Een groep chemici van het Institute of Transformative Bio-Molecules (ITbM), Universiteit van Nagoya, heeft een nieuwe nabij-infrarood (NIR) uitstralende fotostabiele fluorescerende kleurstof PREX 710 (fotoresistente xantheenkleurstof die kan worden geëxciteerd bij 710 nanometer) ontwikkeld voor toepassingen variërend van langdurige beeldvorming met één molecuul tot in vivo diepe beeldvorming, volgens een studie gerapporteerd in het tijdschrift Internationale editie van Angewandte Chemie .

PREX 710 heeft een moleculaire structuur die bestaat uit een fosfineoxide (P=O) groep in de plaats van zuurstof in de gefuseerde tricyclische xantheenkern, en 2 methoxy (OMe) groepen op de perifere aromatische ring, waardoor de kleurstof kan absorberen en uitzenden in het NIR-gebied, en is goed voor zijn hoge chemische en fotostabiliteit, respectievelijk. In aanvulling, de PREX 710 NHS-ester kan chemisch worden gekoppeld aan biomoleculen, waaronder eiwitten, suikers, en kleine organische liganden, wat kan leiden tot observaties van verschillende structuren en gebeurtenissen in levende cellen.

Samen met de onderzoekers van RIKEN en Ehime University, het team heeft ontdekt dat PREX 710 kan worden gebruikt voor fluorescente beeldvorming met één molecuul onder fysiologische omstandigheden. De hoge fotostabiliteit van PREX 710 maakt herhaalde beeldvorming mogelijk, en zijn specifieke lichtabsorptie/emissie-eigenschappen in het NIR-gebied, maakt meerkleurenbeeldvorming mogelijk bij gebruik met andere fluorescerende kleurstoffen. Bovendien, door PREX 710 NHS-ester te koppelen aan een polysacharide (dextraan), het team slaagde in de 3D diepe in vivo beeldvorming van bloedvaten in muizenhersenen. Dit werd mogelijk gemaakt door de hoge chemische stabiliteit van PREX 710 in de bloedstroom, evenals door het gebruik van NIR-straling om diep in de weefsels te kijken. De hoge fotostabiliteit, oplosbaarheid in water en chemische stabiliteit, samen met zijn lage cytotoxiciteit, en het gebruik van NIR-straling maakt PREX 710 een krachtig hulpmiddel voor het visualiseren van moleculaire processen en structuren voor lange duur zonder fotobleking in levende organismen.

Fluorescentiebeeldvorming is een techniek waarbij een specifiek eiwit of celorganel wordt gelabeld met een fluorescerende sonde en wordt gebruikt om processen en structuren van organismen onder een fluorescerende microscoop te visualiseren. Hoewel veel fluorescerende labelmiddelen, zoals fluorescerende eiwitten en kleine fluorescerende organische moleculen zijn tot nu toe ontwikkeld, de meeste van hen gebruiken straling in het zichtbare gebied. De nadelen van het gebruik van zichtbaar licht zoals blauw of groen licht komen voort uit de hoge energie, die schade kunnen veroorzaken aan levende monsters wanneer ze gedurende lange tijd worden blootgesteld. In aanvulling, wanneer de monsters worden geëxciteerd met zichtbaar licht, autofluorescentie van de monsters zelf hebben de neiging om te interfereren met de signalen van de fluorescerende sondes. Het is ook bekend dat biomoleculen zoals hemoglobine de neiging hebben om zichtbaar licht te absorberen, zodat het licht niet diep in de organismen komt, waardoor het moeilijk is om levende bloedvaten en organen te visualiseren.

Deze problemen die voortkomen uit beeldvorming met zichtbaar licht kunnen worden opgelost met behulp van NIR-straling, die een langere golflengte heeft, dus minder energie, vergeleken met zichtbaar licht. Niettemin, veel van de tot nu toe ontwikkelde NIR-kleurstoffen zijn gebaseerd op cyaninekleurstoffen, die bestaan ​​uit polymethineketens (methine (CH) groepen verbonden door afwisselende enkele en dubbele bindingen) die stikstofbevattende heterocyclische verbindingen hebben aan elk uiteinde van de keten. De meeste cyaninekleurstoffen hebben een lage chemische en fotostabiliteit, waardoor bio-imaging op lange termijn moeilijk wordt met deze kleurstoffen als gevolg van fotobleking na verloop van tijd. Hoewel anti-vervagingsmiddelen kunnen worden toegevoegd om fotobleken te voorkomen, ze zijn mogelijk niet toepasbaar in experimenten met levende cellen.

"De Yamaguchi-groep was geïnteresseerd in het maken van fotostabiele kleurstoffen voor bio-imaging die absorberen en uitzenden in verschillende golflengten, " zegt Dr. Masayasu Taki, een universitair hoofddocent in de groep van professor Shigehiro Yamaguchi bij ITbM, en een van de leiders van dit onderzoek. "Het is bekend dat de excitatie- en emissiegolflengten van kleurstoffen toenemen met een toename van geconjugeerde dubbele bindingen in de structuur, maar meer ringen maken de synthese ingewikkeld en leiden ook tot een lage oplosbaarheid in water, wat niet ideaal is voor beeldvorming onder fysiologische omstandigheden. We hebben daarom besloten om verschillende kleurstoffen te synthetiseren door de elementen op de kern xantheenring te veranderen van zuurstof in fosfor."

"Dr. Marek Grzybowski, een postdoctoraal onderzoeker in onze groep, heeft aan dit project gewerkt, en heeft de syntheses bedacht van veel van de op rhodamine gebaseerde fluorescerende kleurstoffen die recentelijk in onze groep zijn ontwikkeld, " beschrijft Taki.

Tijdens hun studie hebben de groep ontdekte ook dat een van de derivaten van PREX 710 vatbaar was voor aanval op een gereduceerde vorm van glutathion (GSH), dat is een tripeptide dat werkt als een antioxidant in cellen. Hoewel ontkleuring van kleurstoffen door GSH over het algemeen als een nadeel wordt beschouwd bij fluorescerende live-beeldvorming, de groep dacht dat deze kleurstof zou kunnen dienen als een veelbelovende NIR-sonde om het GSH-niveau in levende cellen en weefsels te controleren.

"Na het synthetiseren en testen van verschillende xantheenderivaten, we hebben PREX 710 gevonden, die uitzonderlijke chemische en fotostabiliteit vertoonden, en bleek dus een praktische NIR-emitterende fluorofoor te zijn, die zelf membraandoorlatend is en zich voornamelijk lokaliseert in de mitochondriën van levende HeLa-cellen, " legt Taki uit. "We waren erg enthousiast om te zien dat door PREX 710 te gebruiken, we konden gedurende vele minuten levende celcomponenten visualiseren in vergelijking met slechts een paar seconden die met conventionele kleurstoffen zouden kunnen worden bereikt."

In samenwerking met Dr. Yasushi Okada, een teamleider bij het RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, het team vond PREX 710 toepasbaar voor fluorescentiebeeldvorming met één molecuul, een techniek waarvan bekend is dat deze sterke lichtstraling vereist. Hun studies tonen aan dat onder dezelfde experimentele omstandigheden, 80% van de fluorescentiesignalen van één molecuul van PREX 710 konden gedurende 2 minuten worden gedetecteerd, terwijl de helft van de signalen binnen 20 seconden verdween met Alexa Fluor 647 (cyaninekleurstof). De experimenten tonen aan dat PREX 710 elk afzonderlijk molecuul gedurende langere perioden duidelijk kan visualiseren zonder enige fotobleking in afwezigheid van middelen tegen vervaging.

In aanvulling, het team kon PREX 710 gebruiken in de veelkleurige beeldvorming van levende HeLa-cellen. Aangezien de NIR-excitatie- en emissie-eigenschappen van PREX 710 verschillen van fluorescerende kleurstoffen voor zichtbaar licht, spectrale overspraak kan worden vermeden om celcomponenten te visualiseren die elk met verschillende kleurstoffen zijn gekleurd. Bijvoorbeeld, meerkleurige beeldvorming van levende HeLa-cellen was mogelijk na kleuring van het celmembraan, kern en mitochondriën met in de handel verkrijgbare fluorescerende kleurstoffen zoals DiI en SiR-DNA, samen met PREX 710, respectievelijk.

Het praktische nut van PREX 710 werd ook aangetoond door de sonde toe te passen voor de in vivo diepe beeldvorming, die tot stand is gekomen in samenwerking met Drs. Takeshi Imamura en Ryosuke Kawakami van de Ehime University. Met behulp van de bioconjugatieplaats van PREX 710, dextran, een polysacharide bestaande uit glucosemoleculen, werd fluorescent gelabeld en via de muisstaartader in de bloedbaan geïnjecteerd. Het 3D-beeld van bloedvaten in muizenhersenen kon worden geconstrueerd vanwege de hoge helderheid van PREX 710 in het NIR-gebied dat opname van de fluorescentiesignalen in diep weefsel mogelijk maakt.

"We waren verheugd om aan te tonen dat PREX 710 en zijn derivaten nuttige hulpmiddelen zijn voor het onderzoek naar de dynamiek van levende organismen, weefsels, cellen, en moleculen, ", zegt Taki. "We werken momenteel aan de ontwikkeling van andere NIR-fluorescentieprobes die kunnen worden gebruikt voor het kleuren van specifieke eiwitten en voor het nader onderzoeken van levende structuren en processen. We hopen dat dit zal leiden tot de visualisatie en opheldering van verschillende fenomenen in levende systemen, inclusief medische symptomen, " hij zegt.