Wat gebeurt er in een cel als genetische informatie wordt vertaald in eiwitten? Om dit proces te bestuderen, onderzoekers bestuderen een bepaald biomolecuul in de cel:boodschapper ribonucleïnezuur, mRNA in het kort. Dit biomolecuul speelt een belangrijke rol in alle cellulaire processen - en het is ook de focus van gezamenlijk onderzoek dat wordt uitgevoerd door twee groepen van het Cells-in-Motion Cluster of Excellence van de Universiteit van Münster. Een van de groepen bestaat uit biochemici en wordt geleid door prof.dr. Andrea Rentmeister; de andere bestaat uit moleculair biologen en wordt geleid door dr. Sebastian Leidel.

In hun interdisciplinaire samenwerking de onderzoekers zijn er voor het eerst in geslaagd om een ​​belangrijke verandering in messenger-RNA, de zogenaamde m6A-modificatie, chemo-enzymatisch te labelen en vervolgens te detecteren met behulp van moderne moleculair biologische methoden. "Deze nieuwe aanpak stelt ons in staat om modificaties in mRNA te lokaliseren met een grotere mate van nauwkeurigheid dan ooit tevoren, " zegt Andrea Rentmeister, een professor bij de Cluster of Excellence die de studie leidde. Weten waar en in welke mate m6A-modificaties plaatsvinden, zou onderzoekers kunnen helpen deze modificatie in fysiologische en pathologische processen te begrijpen. Het onderzoek is gepubliceerd in de Angewandte Chemie (International Edition) tijdschrift.

De genetische informatie van het DNA wordt getranscribeerd in boodschapper-RNA in een proces dat bekend staat als transcriptie. Na transcriptie, mRNA transporteert de genetische informatie van de celkern naar het cytoplasma. Daar, het dient als een gids voor de productie van eiwitten. Eiwitten zijn de werkpaarden die alle cellulaire taken uitvoeren.

Net als dubbelstrengs DNA, enkelstrengs RNA bestaat uit een keten van zogenaamde nucleotiden. bij RNA, echter, er zijn ook veel chemische veranderingen in deze nucleotiden - bekend als RNA-modificaties. Deze wijzigingen vinden plaats nadat de genetische informatie is gelezen. In het proces, eenvoudige atomaire rangschikkingen - de methylgroepen - zijn aan de nucleotiden gehecht. "Een modificatie waarover momenteel veel wordt gedebatteerd, is de N6-methyladenosine, kortweg m6A genoemd, ", zegt Andrea Rentmeister. Deze wijziging is zeer interessant omdat het verantwoordelijk lijkt te zijn voor een reeks biologische processen, waaronder de circadiane klok. Het lijkt ook een rol te spelen bij pathologische processen, bijvoorbeeld bij sommige vormen van kanker of bij virale infecties.

Biochemici labelden RNA-modificaties chemo-enzymatisch

Om een ​​beter begrip van m6A te krijgen, de onderzoekers zochten uit waar precies in het mRNA de modificatie zich bevond. Om moleculen te labelen, biologen gebruiken vaak antistoffen die zich eraan hechten. Deze methode heeft zijn beperkingen, echter; de antilichamen kunnen niet alleen binden aan de modificaties van het mRNA, maar ook naar naburige nucleotiden. Dit maakt het moeilijk om de wijzigingen precies te lokaliseren. "We wilden nu de etikettering uitvoeren met een chemische benadering, " legt Andrea Rentmeister uit. Voor de eerste keer, zij en haar team gebruikten propargylgroepen, een iets langer koolwaterstofresidu.

De onderzoekers koppelden de propargylgroepen aan het cosubstraat van het enzym, en combineerde alle drie de componenten met mRNA-moleculen in de reageerbuis. In zijn chemische structuur, propargyl is vergelijkbaar met een natuurlijk molecuul gebonden door een methyltransferase. Methyltransferasen zijn op hun beurt enzymen die verantwoordelijk zijn voor de modificatie van mRNA. Dus, de methyltransferasen waren in staat om de propargylgroep over te dragen naar het RNA. Met behulp van zogenaamde klikchemie, de wetenschappers waren in staat om het RNA te isoleren en te zuiveren met propargylgroepen.

Moleculair biologen hebben RNA-modificaties gedetecteerd met behulp van Next Generation Sequencing

Om de specifiek gelabelde wijzigingen te detecteren, de onderzoekers gebruikten een speciaal enzym om mRNA terug in DNA te transcriberen. De resulterende DNA-streng is een kopie van het vorige RNA en kan worden onderzocht met behulp van moleculair biologische methoden. De onderzoekers hebben deze nieuw gesynthetiseerde DNA-streng gesequenced, het lezen van de sequenties van nucleotiden. Ze gebruikten sequencing van de volgende generatie, waardoor ze de sequenties van nucleotiden uiterst efficiënt konden bepalen. "Deze methode stelt ons in staat om duizenden sequenties parallel te analyseren, ", legt Sebastiaan Leidel uit.

Omdat de onderzoekers de modificaties hadden gelabeld met de propargylgroepen, de enzymen die nodig zijn voor het herschrijven van het RNA gestopt. Als resultaat, ze slaagden er niet in het RNA terug in DNA te transcriberen. "De enzymen stopten elke activiteit op de gelabelde plaatsen en genereerden een soort stopsignaal, " zegt Katja Hartstock, een chemicus en hoofdauteur van het verhaal. De onderzoekers konden deze stopsignalen bepalen tijdens de sequencing, wat betekende dat ze de plaatsen konden detecteren waarop de mRNA-modificatie plaatsvond.

Na de eerste experimenten in de reageerbuis, de onderzoekers pasten hun nieuwe methode toe in een cultuur van menselijke epitheelcellen - HeLa-cellen. De onderzoekers voedden de cellen met een propargyl-gelabelde zogenaamde aminozuurprecursor, die de cellen "eten, " en vervolgens begonnen met de etikettering. Zoals al vastgesteld in de reageerbuis, de propargylgroepen hechtten zich aan het RNA met behulp van methyltransferasen en maakten de detectie van de mRNA-modificatieplaatsen mogelijk door middel van Next generation sequencing.

De volgende stap die de onderzoekers willen zetten is om hun methode toe te passen op levende organismen om de betekenis van de modificatie binnen hun ontwikkeling te bestuderen. Zebravissen zijn hier zeer geschikt voor omdat ze zich zeer snel ontwikkelen en de modificaties daarom sneller worden getranscribeerd - en ook sneller worden verwijderd.