Wetenschappers van DESY hebben een nieuwe methode ontwikkeld die geautomatiseerde en snelle screening van veelbelovende kandidaat-geneesmiddelen mogelijk maakt. Deze nieuwe techniek, genaamd mix-and-diffuse seriële synchrotron kristallografie, kan de interactie van potentiële medicijndoelen met medicijnkandidaten of andere moleculen in beeld brengen. Het concept heeft het potentieel om op structuur en fragment gebaseerd medicijnontwerp naar een nieuw niveau te tillen, zoals de onderzoekers schrijven in de Tijdschrift van de Internationale Unie voor Kristallografie ( IUCrJ ).

Veel eiwitten in het lichaam zijn potentiële doelwitten voor geneesmiddelen. Farmaceutische moleculen met de juiste vorm kunnen aan deze eiwitten binden en hun functie activeren of deactiveren. Bijvoorbeeld, om bepaalde vormen van leukemie te bestrijden, het kankermedicijn Imatinib remt een overactieve variant van het enzym tyrosinekinase, een eiwit dat verantwoordelijk is voor het activeren van vele andere eiwitten. Imatinib blokkeert de actieve plaats van dit tyrosinekinase. Om dit te bereiken, het medicijnmolecuul moet precies in de actieve plaats passen zoals een sleutel in een slot. Op basis van de kennis van de ruimtelijke structuur van het enzymdoelwit, Imatinib is hiervoor op maat gemaakt.

"Deze strategie wordt op structuur gebaseerd medicijnontwerp genoemd en wordt tegenwoordig gebruikt als een standaardmethode bij de ontwikkeling van farmaceutische geneesmiddelen, " legt eerste auteur Kenneth Beyerlein van het Center for Free-Electron Laser Science (CFEL) uit, een samenwerking van DESY, de Universiteit van Hamburg en de Duitse Max Planck Society. "Echter, in werkelijkheid is het richten op eiwitten veel complexer dan het plaatsen van een sleutel in een slot. Daarom, veel potentiële farmaceutische moleculen of fragmenten van dergelijke moleculen moeten worden getest, wat meestal een langdurige en gecompliceerde procedure is." zowel biologen als farmacologen zijn geïnteresseerd in de precieze werking van natuurlijke middelen die zich binden aan eiwitten, om de machinerie van het leven beter te begrijpen.

Het systeem ontwikkeld door het team rond Beyerlein en zijn DESY-collega Dominik Oberthür, ook van CFEL, biedt een nieuwe manier om dit doel na te streven:het mengt microkristallijne eiwitten met specifieke moleculen die liganden worden genoemd en die kandidaat-geneesmiddelen of natuurlijke middelen kunnen zijn net voordat de kristallen met röntgenstralen worden onderzocht om de gedetailleerde ruimtelijke structuur van het resulterende eiwit-ligandcomplex of de afwezigheid van een dergelijk complex als een potentieel ligand niet aan het eiwit bindt.

Om de ruimtelijke structuur van een eiwit te analyseren, wetenschappers gebruiken vaak röntgenkristallografie. Voor deze techniek is uit het eiwit moet eerst een kristal worden gekweekt. Onderzoekers nemen vervolgens röntgenfoto's van alle kanten van het kristal dat moet worden gekoeld tot ultralage temperaturen om schade door de intense straling te verminderen. De röntgenstralen produceren een karakteristiek diffractiepatroon waaruit de binnenstructuur van het kristal en daarmee de ruimtelijke structuur van het eiwit kan worden berekend. Om een ​​eiwit met een ligand te onderzoeken, een nieuw kristal moet worden gekweekt uit een eiwit- en ligandoplossing of het kristal moet worden doordrenkt met het ligand. Zelfs met het gebruik van robotica om alle stappen van dit proces te automatiseren, de noodzaak om voor elke nieuwe dataset afzonderlijke kristallen te monteren, is de snelheidsbeperkende stap geworden bij het screenen van grote samengestelde bibliotheken.

De nieuwe techniek volgt een andere benadering. "We gebruiken microkristallen, wat twee voordelen heeft:ze zijn meestal veel gemakkelijker te produceren dan grote kristallen, en ze zijn klein genoeg zodat een potentieel medicijn in een oplossing door het kristal kan diffunderen en binnen enkele milliseconden aan alle eiwitmoleculen kan binden, ", legt Oberthür uit. Het systeem dat is ontwikkeld door het team van Oberthür en Beyerlein verdeelt een stroom microkristallen in een dragervloeistof op een dunne tape. Als een transportband, de band draagt ​​de kristallen door de röntgenstraal, dat in korte flitsen wordt gehakt door een roterende jaloezie. In plaats van een groot kristal in de röntgenstraal te roteren, veel microkristallen in willekeurige oriëntatie worden dus serieel aan röntgenstralen onderworpen en de diffractiepatronen van elke opname worden later gecombineerd om een ​​complete dataset te vormen, volgens het concept van seriële kristallografie dat voor het eerst werd ontwikkeld met röntgenlasers met vrije elektronen (XFEL's).

Via een tweede klep in het systeem, een oplossing van een kandidaat-geneesmiddel of natuurlijk ligand wordt toegevoegd. Het punt waar de twee vloeistoffen kunnen worden gemengd, kan worden aangepast om een ​​gedefinieerde vertraging te creëren voordat de structuur wordt onderzocht. Deze opstelling vereist geen cryo-koeling van kristallen, daarom kan de interactie tussen eiwit en geneesmiddel worden waargenomen bij fysiologische temperaturen, of een andere gewenste temperatuur. Op deze manier, zelfs de bindingsdynamiek kan worden onderzocht. "We kunnen in een oogwenk chemicaliën in de eiwitkristallen diffunderen en kijken hoe de binding plaatsvindt, " legt Oberthür uit. "Je hoeft niet voor elke remmer nieuwe groeicondities te vinden en je hoeft de kristallen niet handmatig te verwisselen, het hele proces kan worden geautomatiseerd."

Het team testte het nieuwe systeem in DESY's hoog-schitterende röntgenbron PETRA III met het bekende eiwit lysozym en een suikermolecuul, chitotriose, dat remt het enzym. De lysozyme-microkristallen die hier werden gebruikt, waren slechts ongeveer zes tot acht micrometer in diameter. De opstelling op meetstation P11 onthulde in detail de ruimtelijke structuur van de aan lysozym gebonden ingemengde remmer. En hoewel de structuur van lysozyme de eerste enzymstructuur was die 50 jaar geleden door röntgenkristallografie werd onthuld, de nieuwe methode zou nog steeds nieuwe details kunnen onthullen over de bindingsmodus van chitotriose aan lysozym, het oplossen van een controverse over de voorkeursbindingsplaats van het suikermolecuul.

Hoewel de proof of principle nog enige tijd nodig had, routinematige en verdere vooruitgang in detector- en röntgentechnologie zullen de procedure aanzienlijk versnellen. Ook, het gebruik van het hele röntgenbundelspectrum van de synchrotron-lichtbron in plaats van slechts een enkele "kleur" ervan, kan de belichtingstijd voor individuele diffractiebeelden terugdringen tot 100 picoseconden, of 0,1 miljardste van een seconde. Slechts 50 van deze afbeeldingen zijn voldoende om de structuur te bepalen, zoals onlangs bleek.

"We ontwikkelen manieren om de structuur van gebonden eiwitten op te lossen voor high-throughput drug discovery, ", legt Beyerlein uit. Omdat synchrotron-lichtbronnen toegankelijker zijn dan röntgenlasers, de onderzoekers stellen zich voor deze methode te gebruiken voor routinematige screening door bibliotheken van potentiële remmers en medicijnfragmenten. "Om dit automatisch en veel sneller te doen dan met conventionele benaderingen, zou een grote stap voorwaarts zijn in het op structuren gebaseerde medicijnontwerp, ', zegt Beyerlein.