Verschillende op afbeeldingen gebaseerde schattingen van de centrale positie (genaamd "zwaartepuntaanpassing"), zoals 2-D Gauss-aanpassingsmethoden, zijn vaak gebruikt in lokalisatiemicroscopie met één molecuul (SMLM) om de locatie van elke fluorofoor nauwkeurig te bepalen. Toch is het nog steeds een uitdaging om de laterale lokalisatieprecisie van een enkel molecuul op moleculaire schaal te verbeteren ( <2 nm) voor beeldvorming met een hoge doorvoer nanostructuur.

In een online gepubliceerde studie in Natuurmethoden , Prof. Xu Tao en Prof. Ji Wei van het Instituut voor Biofysica van de Chinese Academie van Wetenschappen ontwikkelden een nieuw interferometrisch lokalisatiemicroscopieproces met één molecuul met snel gemoduleerde gestructureerde verlichting, genaamd Repetitive Optical Selective Exposure (ROSE).

ROSE maakt gebruik van zes verschillende richting- en fase-interferentieranden om de fluorescerende moleculen te prikkelen. De intensiteit van de fluorescerende moleculen hangt nauw samen met de fase van de interferentieranden. Een fluorescentiemolecuul wordt gelokaliseerd door de intensiteiten van meerdere excitatiepatronen van een interferentierand, het verstrekken van ongeveer tweevoudige verbetering in lokalisatie precisie. Deze techniek heeft de resolutie van lokalisatiemicroscopie met één molecuul (SMLM) tot minder dan 3 nm (~ 1 nm lokalisatieprecisie) geduwd.

De onderzoekers ontwierpen eerst drie verschillende roosters van DNA-origamistructuren met 5-, Punt-tot-punt afstand van 10 en 20 nm om de prestaties van ROSE te verifiëren. Zowel conventionele zwaartepuntfitting als ROSE zouden de 20-nm-structuur kunnen oplossen met hetzelfde fotonenbudget. ROSE kon ook duidelijk de afstand van 10 nm oplossen, die niet kon worden opgelost door zwaartepunt montage.

De onderzoekers toonden aan dat ROSE een structuur van 5 nm kon oplossen met een resolutie van ~ 3 nm over een groot gezichtsveld van 25 x 25 μm ² , wat betekent dat ROSE het vermogen heeft om het oplossend vermogen van SMLM naar de moleculaire schaal te duwen.

In aanvulling, ROSE gebruiken om cellulaire nanostructuren te analyseren, de onderzoekers toonden aan dat ROSE voordelen heeft bij het oplossen van de holle structuur van enkele microtubuli-filamenten, kleine clathrin-coated pits (CCP's) en cellulaire nanostructuren van actinefilament. De Fourier-ringcorrelatie (FRC) -analyse gaf aan dat ROSE de uiteindelijke resolutie tweevoudig verbeterde in vergelijking met de zwaartepunt-aanpassingsmethode.

ROSE kan worden uitgebreid tot 3D-beeldvorming op nanometerschaal door extra excitatiepatronen langs de axiale richting te introduceren. De onderzoekers voorzien dat deze methode de toepassing van SMLM in dynamische analyse van biomacromoleculen en structurele studies op moleculaire schaal zou kunnen uitbreiden.