Voor de eerste keer, onderzoekers hebben de ionenpompen waargenomen die celtransport en signaalsystemen activeren. Dit zorgt voor de functie van biomoleculaire mechanismen.

Elke calciumpomp meet slechts enkele nanometers in elke richting, en zit in de celmembranen. Maar ondanks zijn kleine formaat, het is cruciaal voor het leven. Deze pomp is de reden dat onze spieren kunnen samentrekken, en dat neuronen signalen kunnen sturen. Als de kleine pomp stopte met werken, cellen zouden stoppen met communiceren. Dit is de reden waarom cellen zo veel van hun energie gebruiken – ongeveer een vierde van de lichaamsbrandstof, bekend als ATP - om de pompen draaiende te houden.

Er zijn veel dingen die we nog niet weten over de structuur en functie van deze vitale pomp. Kennis over de pomp is essentieel om de energiebalans en andere belangrijke functies in het lichaam te begrijpen.

Een Deense onderzoeksgroep heeft zojuist een nieuwe studie gepubliceerd die voor het eerst laat zien hoe de pomp functioneert op het niveau van een enkel molecuul, en hoe het ervoor zorgt dat ionen in de goede richting worden gepompt. Met andere woorden, hoe de pomp werkt als een moleculair eenrichtingsverkeer. De ontdekking is zojuist gepubliceerd in het prestigieuze tijdschrift Natuur .

"Dit werk vertegenwoordigt de volgende stap van een diepgaande en belangrijke zoektocht om de atomaire structuur en functie van de pomp te begrijpen. We zijn nu een stap dichter bij het begrijpen hoe de ionenpompen de functies van de cellen verzekeren. We hebben gekarakteriseerd hoe het ionen uit de pomp pompt. de cel op een ongekend detailniveau. Het belang van dergelijke basiskennis van biofysische processen kan alleen maar worden onderschat. Het zal een grote invloed hebben op ons begrip van de levensprocessen en, op tijd, over ziektebehandeling, ", zegt professor Poul Nissen. Professor Nissen is een van 's werelds toonaangevende experts op het gebied van deze familie van pompen en een co-auteur van het artikel.

De moleculaire backstop

Tot op zekere hoogte, het verhaal begon in de jaren vijftig, toen professor Jens Christian Skou zijn pionierswerk deed aan de universiteit van Aarhus, die de pompfuncties in onze cellen blootlegde. De calciumpomp is een naaste neef van de natrium-kaliumpomp waaraan Skou werkte, en ze gebruiken een soortgelijk pompmechanisme. Skou's werk leverde hem in 1997 de Nobelprijs voor scheikunde op. talrijke onderzoekers hebben het mechanisme en de functie van deze pompen bestudeerd, waaronder velen bij het Center for Membrane Pumps in Cells and Disease – PUMPkin – aan de Universiteit van Aarhus.

Een belangrijk inzicht in de nieuwe publicatie betreft het eenrichtingskarakter van ionentransport. Eerder, aangenomen werd dat het eenrichtingskarakter van de pomp ontstond bij de splitsing van het energierijke molecuul ATP. De hypothese was dat wanneer ATP werd gesplitst, de pomp kon niet terugdraaien en ATP hervormen. Dat bleek onjuist te zijn.

"We hebben een nieuwe gesloten toestand in de pompcyclus geïdentificeerd, waar de pomp alleen in kan als het calciumion uit de intracellulaire vloeistoffen komt en de pomp ATP heeft gesplitst. Het kan deze toestand niet bereiken als het ion uit de omgeving van de cel komt. Wanneer calcium uit deze toestand vrijkomt, het is het 'point of no return'. Dit is het mechanisme dat verklaart dat de pomp werkt als een pomp en niet alleen als een passief kanaal. Dit werkelijk unieke inzicht is gebaseerd op zeer geavanceerde experimenten. Deze experimenten stellen ons in staat om de pomp voor het eerst direct zijn werk te zien doen, " zegt postdoctoraal onderzoeker Mateusz Dyla, de eerste auteur van het nieuwe artikel.

De calciumpomp heeft energie nodig, die het krijgt van het splitsen van een ATP-molecuul. De vrijkomende energie wordt omgezet in het werk van de pomp. Dit verklaart hoe grote concentratiegradiënten ontstaan ​​tussen de binnenkant en de buitenkant van de cel. Het concentratieverschil kan meer dan 10 zijn, 000-voudig, en dit grote verschil is essentieel voor de communicatie tussen cellen, zoals bij zenuwsignalering.

Rook en spiegels

De reden waarom de experimenten zo complex zijn, is vrij duidelijk. De pomp is zo klein dat deze niet direct in een lichtmicroscoop kan worden afgebeeld. Tot dusver, en met grote moeite, onderzoekers hebben moleculaire modellen gemaakt van stabiele toestanden van de pomp met behulp van een techniek die bekend staat als röntgenkristallografie. Dit is vergelijkbaar met een stop-motionfilm. De wetenschappers hebben gekscherend verwezen naar hun visualisatie van de beweging van de pomp tussen deze toestanden als 'Pump Fiction'. De nieuwe studie, waaraan vijf jaar is gewerkt, verplaatst de visualisatie van stop motion naar live beelden van de functionele bewegingen van de pomp. Door technische verbeteringen in microscopische technieken kon de nieuwe toestand worden waargenomen.

De techniek staat bekend als single-molecule fluorescentiespectroscopie, en maakt gebruik van een fenomeen dat bekend staat als Förster-resonantie-energieoverdracht, kortom FRET. Hier, intens laserlicht en ultragevoelige camera's worden gecombineerd om de directe waarneming van een enkel molecuul mogelijk te maken door de kleine hoeveelheid licht die elk molecuul uitstraalt.

De onderzoeksgroep heeft gebruik gemaakt van een calciumpomp van de bacterie Listeria, die werd voorbereid voor de studies door middel van eiwittechnologie. De engineering van het eiwit alleen al nam enkele jaren in beslag.

In de FRET-experimenten, twee kleurstofmoleculen zijn aan het eiwit gehecht, die vervolgens wordt verlicht door laserlicht. een kleurstof, de schenker, absorbeert het laserlicht en geeft het ofwel af met een karakteristieke kleur, of als alternatief de energie overdraagt ​​aan de andere kleurstof, de acceptant. Deze zal dan licht met een andere kleur uitstralen. Er zal dus licht worden uitgestraald door de twee kleurstoffen, en wetenschappers kunnen de afstand tussen de twee kleurstoffen meten door te meten hoeveel licht er van elke kleur wordt uitgestraald. Omdat de kleurstoffen zorgvuldig op twee specifieke posities in de pomp zijn ingebracht, deze afstandsveranderingen volgen de pompbewegingen van de pomp.

De techniek met één molecuul maakte de nieuwe ontdekkingen mogelijk, zoals uitgelegd door collega Magnus Kjærgaard, Aarhus Instituut voor geavanceerde studies (AIAS), die ook hebben bijgedragen aan de ontdekking.

"We zijn overgestapt van 'Pump Fiction' naar 'Pump Live'. we registreerden altijd de signalen van veel moleculen tegelijk, wat de bewegingen vertroebelt. Met behulp van FRET-technieken met één molecuul, we kunnen ons concentreren op één molecuul tegelijk, waardoor we de structurele veranderingen direct kunnen observeren. Dit geeft ons een video van de pomp in actie met minder gaten. Onze Pump Fiction-film kreeg aanvankelijk zijn naam omdat we wisten dat de overgangen tussen de verschillende toestanden van de cyclus fictief waren, en dat er aanvullende inzichten zouden kunnen schuilgaan in de hiaten tussen de bekende toestanden. Dat hebben we nu volop aangetoond, en onthulde tegelijkertijd kritische nieuwe inzichten in hoe de pomp werkt, " hij zegt.

Naast het toevoegen van onze kennis van de basisprocessen van het leven, het begrip van deze pompen kan ook praktische toepassingen hebben. Mutaties in de pompen kunnen defecten in hersencellen veroorzaken, en dit kan neurologische aandoeningen veroorzaken zoals migraine, tijdelijke verlamming of neurodegeneratieve aandoeningen.

De mechanismen van deze ionenpompen zijn dus cruciaal voor het begrijpen van de fouten in de pomp, vooral met het oog op de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen gericht op de pomp.

"We zijn nog niet zover dat we ons ionenpomponderzoek kunnen omzetten in de behandeling van ziekten. de nieuwe inzichten hebben geleid tot ideeën die kunnen worden gebruikt om de behandeling van defecten in neuronale signalering te ontwikkelen, bijvoorbeeld. Maar dit is werk voor de toekomst. Direct, er is alle reden om de onthulling van de intieme details van een van de belangrijkste enzymen van het leven te vieren. Het werk is gebouwd op geweldige samenwerkingen hier op de universiteit, en met onderzoekers in de VS. We zijn al nieuwe spannende samenwerkingen gestart die ons in staat zullen stellen de volgende stappen te zetten, " zegt professor Poul Nissen.