Membraaneiwitten vormen ongeveer een kwart van alle genproducten en zijn het doelwit van meer dan 50 procent van alle moderne farmaceutische geneesmiddelen. Het proteoom van het binnenste mitochondriale membraan (IMM) speelt een centrale rol bij het in stand houden van de mitochondriale fysiologie en het cellulaire metabolisme. Ondanks hun belang, er is geen methode om de topologie van mitochondriale membraaneiwitten in levende cellen te onthullen, tot nu.

Een recente studie, aangesloten bij UNIST heeft een nieuwe techniek ontwikkeld om de juiste architecturen van IMM-eiwitten te begrijpen, met behulp van speciaal chemisch gereedschap. Door de moeilijkste fase van de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen op te lossen, hun werk zal de ontwikkeling van nieuwe therapieën en geneeswijzen helpen versnellen.

Dit onderzoek is geleid door het team van professor Hyun-Woo Rhee of Chemistry bij UNIST in samenwerking met professor Jong-Seo Kim bij Center van het Center for RNA Research, binnen het Institute for Basic Science (IBS) aan de Seoul National University en professor Jeong-Kon Seo van UNIST Central Research Facilities (UCRF). De resultaten van het onderzoek zijn verschenen in de editie van 15 maart van het Tijdschrift van de American Chemical Society ( JACS ).

IMM is een van de meest actieve plaatsen voor cellulair metabolisme en is nauw verwant aan verschillende menselijke stofwisselingsziekten, waaronder kanker en neurodegeneratieve ziekten. Daarom, het is van cruciaal belang om de juiste architectuur van het IMM-proteoom in levende cellen te begrijpen voor een succesvolle en efficiënte ontwikkeling van op mitochondriën gerichte therapieën.

In de studie, Professor Lee en zijn onderzoeksteam onthulden de in vivo topologische richting van 135 IMM-eiwitten, met behulp van een in situ gegenereerde desthiobiotin-fenoxylradicaalsonde met genetisch gerichte peroxidase (APEX).

"De bepaling van de membraaneiwitstructuur is een van de meest uitdagende taken bij de analyse van de eiwitstructuur, " zegt professor Lee. "Onze identificatie van structurele informatie over het mitochondriale binnenmembraan-proteoom kan waardevolle inzichten opleveren voor de architectuur en het connectoom van het IMM-proteoom in levende cellen."

Het onderzoeksteam ontwierp een nieuwe chemische sonde, desthiobiotin-fenol en toegepast op de IMM-eiwitten in levende cellen. Vervolgens, ze identificeerden de structuur van membraaneiwitten via massaspectrometrie (MS).

Peroxidase kan reageren met waterstofperoxide om de fenoxylradicaal te maken. Vervolgens, het fenoxylradicaal kan reageren met het tyrosineresidu op het proximale eiwit en een covalente binding vormen. In de studie, het onderzoeksteam verkreeg de topologie-informatie door de gelabelde tyrosineplaats van het membraaneiwit te analyseren.

Het merendeel van de eiwitsequentie-analyse maakt tegenwoordig gebruik van massaspectrometrie (MS), die het eiwitmonster verteert tot peptiden met behulp van een geschikt enzym. eerdere analyses, die genetisch gerichte ascorbaatperoxidase (APEX) gebruikten, kon structurele identificatie niet oplossen omdat deze analyses waren gebaseerd op niet-gelabelde peptidedetectie. Echter, alleen het gelabelde peptide kan nuttige structurele informatie verschaffen, aldus het onderzoeksteam.

In tegenstelling tot biomoleculen die zijn gelabeld met biotine-fenol, eiwitten en andere doelwitten die zijn gelabeld met desthiobiotin-fenol kunnen worden geëlueerd zonder hard, denaturerende omstandigheden. Bovendien, naarmate het aantal beschikbare membraaneiwitstructuurmonsters verkregen via MS toeneemt, de efficiëntie van structurele identificatie van membraaneiwitten neemt ook toe.

Als gevolg van de korte levensduur van fenoxylradicalen die in situ worden gegenereerd door op subsubjectochondriale gerichte APEX en de ondoordringbaarheid van de IMM voor kleine moleculen, de aan oplosmiddelen blootgestelde tyrosineresiduen van zowel de matrix- als de intermembrane space (IMS)-zijden van IMM-eiwitten werden exclusief gelabeld met de radicale sonde in levende cellen door Matrix-APEX en IMS-APEX, respectievelijk en geïdentificeerd door massaspectrometrie.

Door deze analyse, het onderzoeksteam bevestigde 58 IMM-eiwittopologieën en bepaalde de topologische richting van 77 IMM-eiwitten waarvan de topologie bij de IMM niet volledig is gekarakteriseerd.