Door Palmer Owyoung
Bijgewerkt op 30 augustus 2022

Jupiterimages/Photos.com/Getty Images

De genetische code van een cel bevindt zich in het DNA, dat opgesloten blijft in de kern. Om genexpressie te bestuderen of om complementaire DNA-bibliotheken (cDNA) te genereren, moet het DNA eerst worden getranscribeerd in messenger-RNA (mRNA). Het isoleren van mRNA van hoge kwaliteit is essentieel voor het detecteren van zeldzame transcripten, het ontwerpen van microarray-sondes en het construeren van cDNA-bibliotheken.

Isolatie van mRNA uit totaal RNA

Stap 1 – TRIzol-homogenisatie

Begin met het resuspenderen van gepelletiseerde cellen in TRIzol-reagens (Life Technologies) of een gelijkwaardige fenol-guanidine-oplossing zoals Ambion's TRI-reagens. Dit reagens lyseert tegelijkertijd cellen, denatureert eiwitten en beschermt RNA tegen enzymatische afbraak.

Stap 2 – Totale RNA-isolatie

Voer een reeks centrifugaties uit om cellulaire componenten in verschillende fasen te scheiden. Gooi de gele, vetrijke toplaag weg. Verzamel de rode waterige fase, die de volledige RNA-populatie bevat (mRNA, tRNA, rRNA en niet-coderende RNA's). Volg het fenol-chloroform-extractieprotocol en was vervolgens de RNA-pellet met isopropanol en ethanol. Voeg overal RNase-remmers toe om de RNA-integriteit te behouden.

Stap 3 – mRNA-extractie

Commerciële kits bieden de meest reproduceerbare mRNA-zuivering. Populaire keuzes zijn onder meer Invitrogen’s FastTrack 2.0 en Ambion’s Poly(A)Pure mRNA Isolation Kit. Een typisch kitprotocol verloopt als volgt:

• Combineer tot 300 µl totaal RNA met de RNase-geremde lysisbuffer uit de kit.
• Verwarm gedurende 5 minuten op 65°C en laat het vervolgens afkoelen op ijs.
• Voeg 0,5 M NaCl toe en los het meegeleverde oligo-dT (oligodeoxythymidylzuur) op in het mengsel.
• Centrifueer en herstel het supernatant; binden het mRNA aan de meegeleverde silicamatrix.
• Herhaaldelijk wassen met een zoutarme buffer en daarna met wasbuffer.
• Elueer het mRNA in het gespecificeerde volume (doorgaans ~500 µL).
• Sla het eluaat neer met natriumacetaat en ethanol en suspendeer vervolgens in 10–20 µl DEPC-behandeld water.
• Bewaren bij –80°C en beoordeel de concentratie en zuiverheid met behulp van een UV-spectrofotometer.

Dingen die nodig zijn

• Laminaire flowkast
• Persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, handschoenen, oogbescherming)
• Pipetten, tips, afvalcontainers voor biologisch gevaarlijk materiaal
• Hogesnelheidscentrifuge, warmteblok
• RNA-vrije bankoppervlakken
• RNAzap- of RNAoff-reagentia
• Commerciële mRNA-extractiekits (Invitrogen, Ambion, enz.)
• Natriumacetaat, ethanol, isopropanol
• DEPC-behandeld water
• UV-spectrofotometer en verbruiksartikelen
• Cellen geschikt voor RNA-extractie
• TRIzol of TRI-reagens
• RNase-remmers

TL;DR

Houd alle reagentia, cellen en geëxtraheerd RNA koud door ze op ijs te plaatsen. Koude omstandigheden remmen de RNase-activiteit die vrijkomt tijdens homogenisatie.

Waarschuwing

TRIzol en soortgelijke fenol-guanidine-reagentia zijn giftig. Vermijd huid- en slijmvliescontact en houd u strikt aan de institutionele veiligheidsprotocollen.

Referenties

• “cDNA-bibliotheekprotocollen”; Ian G. Cowell en Caroline A. Austin, 1997
• “In vitro transcriptie- en vertaalprotocollen”; Martin J. Tymms, 1995