Door Sarah Quinlan
Bijgewerkt op 30 augustus 2022

Volgens BioWeb van de Universiteit van Wisconsin is een PCR-primer een kort, synthetisch oligonucleotide – doorgaans 18 tot 25 nucleotiden lang – dat wordt gebruikt om specifieke DNA-segmenten te amplificeren via polymerasekettingreactie (PCR). Zowel voorwaartse als achterwaartse primers, ontworpen als omgekeerde complementen, flankeren het doelgebied om amplificatie te vergemakkelijken. Wanneer onderzoekers zich op een specifiek gen of DNA-gebied richten, genereert PCR voldoende materiaal voor verdere analyses. Als er geen geschikte primers beschikbaar zijn in de gepubliceerde literatuur of commerciële bronnen, wordt het ontwerpen van op maat gemaakte primers essentieel.

Stap 1

Begin met het ophalen van de nucleotidesequentie van uw doelgen of DNA-regio en bepaal de lengte van het fragment dat u wilt amplificeren. Conventionele PCR amplificeert fragmenten tussen 100 en 1.000 basenparen, terwijl real-time PCR zich doorgaans richt op 50 tot 200 basenparen.

Stap 2

Bepaal waar binnen de reeks uw primers zullen binden:nabij het 5'- of 3'-uiteinde, in het midden of indien gewenst over een intron.

Stap 3

Houd u aan de vastgestelde richtlijnen voor het ontwerpen van primers; het succes van amplificatie hangt af van de primerkwaliteit en de belangrijkste parameters.

Stap 4

Ontwerpprimers van 18–24 nucleotiden lang. Dr. Vincent R. Prezioso, Ph.D., van Brinkmann Instruments beveelt dit bereik aan voor optimale specificiteit en efficiënt uitgloeien. Streef naar een smelttemperatuur (Tm) van 55–80°C, een GC-gehalte van 40–60% en een GC-klem aan het 3'-uiteinde. Vermijd drie of meer G/C-bases op de laatste vijf posities om niet-specifieke binding te verminderen.

Stap 5

Vermijd runs van vier of meer identieke nucleotiden of di-nucleotideherhalingen, aangezien deze tot verkeerde priming kunnen leiden. Zorg ervoor dat er geen intra-primer- of inter-primer-complementariteit bestaat die zelfdimeren of primer-dimeren zou kunnen vormen.

Stap 6

Gebruik gerenommeerde online tools:MIT’s Primer3 , Primer‑Blast van NCBI , en OligoAnalyzer van IDT —om primereigenschappen te evalueren en secundaire structuren te voorspellen.

Dingen die nodig zijn

• Nucleotidesequentie van het doel-DNA-gebied
• Primer-ontwerpsoftware of website