1. Het verkrijgen van het menselijke gen van belang

* Isolatie van menselijk DNA: Het gewenste menselijke gen wordt geëxtraheerd uit menselijke cellen met behulp van technieken zoals restrictie -enzymvertering of PCR (polymerasekettingreactie).

* Synthese: Het gen kan ook kunstmatig worden gesynthetiseerd, met behulp van gensynthesetechnologie, die vaak efficiënter is voor complexe genen.

2. Het voorbereiden van de plasmide vector

* Plasmideselectie: Een geschikte plasmide -vector wordt gekozen, vaak één met meerdere kloneringsplaatsen (MC's), antibioticaresistentiegenen en andere kenmerken die klonen vergemakkelijken.

* Beperking Enzym Digestie: Het plasmide wordt opengesneden op specifieke locaties met behulp van restrictie -enzymen, waardoor "plakkerige uiteinden" worden gecreëerd die compatibel zijn met het menselijke gen.

3. Ligatie (samenvoegen) van het gen en plasmide

* Compatibiliteit: De plakkerige uiteinden van het menselijke gen en het gelineariseerde plasmide zijn ontworpen om compatibel te zijn, waardoor ze samen kunnen binden door complementaire basisparen.

* Ligase -enzym: DNA -ligase wordt gebruikt om de vorming van fosfodiesterbindingen te katalyseren, waardoor het menselijke gen permanent zich in het plasmide verbinden.

4. Transformatie in bacteriën

* Competente cellen: Bacteriecellen worden "competent" gemaakt om DNA op te nemen met verschillende methoden, zoals hitteschok of elektroporatie.

* Inleiding: De recombinante plasmiden worden geïntroduceerd in de competente bacteriën.

* Selectie: Bacteriën die het plasmide met succes hebben opgenomen, worden geselecteerd door ze te laten groeien op media die antibiotica bevatten. Alleen bacteriën met het plasmide zullen groeien vanwege het antibioticaresistentiegen.

5. Verificatie en bevestiging

* Colony PCR: PCR wordt gebruikt om de aanwezigheid van het menselijke gen in de bacteriekolonies te bevestigen.

* sequencing: De ingevoegde gensequentie wordt geverifieerd door DNA -sequencing om ervoor te zorgen dat deze correct en intact is.

Sleutelcomponenten en overwegingen:

* Beperkingsenzymen: Deze enzymen snijden DNA bij specifieke sequenties en creëren compatibele uiteinden voor ligatie.

* DNA -ligase: Dit enzym sluit zich aan bij de uiteinden van DNA -strengen samen.

* Antibioticaresistentiemarkers: Deze genen op het plasmide zorgen voor de selectie van bacteriën die het plasmide met succes hebben opgenomen.

* MCS (meerdere kloneringssites): Dit gebied van het plasmide bevat meerdere beperkingszymlocaties, waardoor verschillende genen kunnen worden ingevoegd.

Waarom is dit belangrijk?

* Productie van eiwitten: Recombinante bacteriën kunnen worden gebruikt om grote hoeveelheden menselijke eiwitten, zoals insuline of groeihormoon, te produceren voor therapeutische doeleinden.

* onderzoekstools: Recombinante plasmiden zijn essentieel voor het klonen van genen en genexpressie.

* Gentherapie: In sommige gevallen kunnen recombinante plasmiden die therapeutische genen bevatten, worden gebruikt om corrigerende genen te leveren aan cellen in gentherapie.

Opmerking: De specifieke details van het proces kunnen variëren, afhankelijk van het gekloonde gen, de bacteriële gastheer en de gewenste toepassing.