Isolatie van genomisch DNA uit aardnootbladeren:een stapsgewijze gids

Dit protocol schetst een basismethode voor het extraheren van genomisch DNA uit aardnootbladeren met behulp van een eenvoudige en kosteneffectieve benadering.

Materialen:

* Aardnootbladeren (vers of bevroren)

* Vloeibare stikstof

* Mortel en stamper

* 1,5 ml microcentrifugebuizen

* 100 mm Tris-HCl (pH 8.0)

* 25 mm EDTA (pH 8.0)

* 1.4 M NaCl

* 10% SDS (natriumdodecylsulfaat)

* Chloroform:isoamylalcohol (24:1)

* Isopropanol

* 70% ethanol

* Rnase een oplossing (10 mg/ml)

* Spectrofotometer

Procedure:

1. Voorbereiding van het monster:

* Verzamel verse of bevroren aardnootbladeren. Als je bevroren bladeren gebruikt, ontdooi ze bij kamertemperatuur.

* Weeg ongeveer 0,1-0,2 g bladweefsel.

* Plaats de bladeren in een voorgesempelde mortel en maal ze tot een fijn poeder met behulp van vloeibare stikstof.

2. lysis:

* Breng de poederblaadjes over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.

* Voeg 500 µl lysisbuffer toe (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 25 mm EDTA, pH 8,0, 1,4 M NaCl en 10% SDS).

* Incubeer de buis 30 minuten bij 65 ° C met af en toe zacht schudden. Deze stap breekt de celwanden en membranen af ​​en brengt het DNA uit.

3. Eiwitverwijdering:

* Voeg 200 µl chloroform toe:isoamylalcohol (24:1) aan de buis.

* Schud de buis krachtig gedurende 10 minuten.

* Centrifugeer de buis bij kamertemperatuur 10.000 x g gedurende 10 minuten. Deze stap scheidt de oplossing in drie lagen:waterige laag (boven), interfase (midden) en organische laag (onder). Het DNA bevindt zich in de waterige laag.

4. DNA -neerslag:

* Breng de waterige laag zorgvuldig over naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis.

* Voeg 0,5 volume isopropanol toe aan de buis en meng zachtjes. Dit zal het DNA uit de oplossing neerslaan.

* Incubeer de buis 30 minuten bij -20 ° C.

* Centrifugeer de buis bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. De DNA -pellet vormt zich aan de onderkant van de buis.

5. Wassen en drogen:

* Verwijder het supernatant en was de DNA -pellet met 500 µl 70% ethanol.

* Centrifugeer de buis bij 10.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C.

* Verwijder de ethanol en drogen de pellet 5-10 minuten.

6. Resuspensie en RNase -behandeling:

* Resuspend de DNA-pellet in 50 µl TE-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mm EDTA, pH 8.0).

* Voeg 1 µl RNase A -oplossing (10 mg/ml) toe aan de buis.

* Incubeer de buis 30 minuten bij 37 ° C om eventuele resterende RNA te verwijderen.

7. DNA -kwantificering en kwaliteitscontrole:

* Kwantificeer het geëxtraheerde DNA met behulp van een spectrofotometer bij 260 nm en 280 nm golflengten. De absorptieverhouding bij 260 nm/280 nm moet tussen 1,8 en 2,0 zijn, wat duidt op zuiver DNA.

Opmerkingen:

* Dit protocol is een basisrichtlijn en moet mogelijk worden aangepast op basis van het specifieke bladmateriaal en de gewenste kwaliteit van het DNA.

* Draag altijd handschoenen en laboratoriumjassen bij het hanteren van biologische monsters.

* Zorg ervoor dat alle reagentia en apparatuur steriel zijn om verontreiniging te voorkomen.

* U kunt ook commerciële DNA -extractiekits gebruiken voor een meer gestroomlijnd en efficiënt proces.

Verdere toepassingen:

* Het geïsoleerde genomische DNA kan worden gebruikt voor verschillende moleculaire biologietoepassingen, waaronder:

* PCR (polymerasekettingreactie)

* DNA -sequencing

* Genetische analyse

* Klonen

Dit protocol biedt een eenvoudige en kosteneffectieve methode voor het isoleren van genomisch DNA van aardnootbladeren, waardoor de weg wordt vrijgemaakt voor verschillende onderzoek en toepassingen.