Een team van onderzoekers van The Scripps Research Institute (TSRI) en Duke University heeft de eerste bepaling gedaan van de atomaire structuur van Transient Receptor Potential Melastatine 8 (TRPM8), een moleculaire sensor in zenuwuiteinden die koude temperaturen detecteert, evenals menthol en andere chemicaliën die koude sensaties veroorzaken.

Deze bevinding zou de voortdurende inspanningen van wetenschappers moeten stimuleren om TRPM8 therapeutisch te richten. Geneesmiddelverbindingen die interageren met de koudesensor - zoals mentholbevattende zalven al doen - kunnen sommige vormen van chronische pijn en ontsteking behandelen, migraine en zelfs kanker.

"Het kennen van de atomaire structuur van TRPM8 en hoe het reageert op kou, menthol en andere stimuli zouden moeten helpen bij het ontwerpen van krachtige en selectieve nieuwe medicijnen die op deze sensor zijn gericht, " zei studieleider Gabriel C. Lander, doctoraat, universitair hoofddocent bij TSRI, die samen met Dr. Seok-Yong Lee de studie leidde aan de Duke University School of Medicine.

De vondst, gepubliceerd op 7 december, 2017 in het journaal Wetenschap , is ook een belangrijke technische prestatie. Sinds het koudegevoelige eiwit voor het eerst werd geïdentificeerd in 2002, teams over de hele wereld hebben geprobeerd, maar slaagden er niet in om de atomaire structuur van TRPM8 te bepalen met behulp van röntgenkristallografie, traditioneel de go-to-methode voor het oplossen van grote eiwitstructuren. Het verkrijgen van een structuur met hoge resolutie van TRPM8 vormt een grote uitdaging voor structurele biologen, deels vanwege de instabiliteit van het kanaal wanneer het geïsoleerd is van zijn natuurlijke omgeving in het celmembraan. Zonder membraanondersteuning, TRPM8 heeft de neiging om zijn structurele integriteit te verliezen, waardoor het doel erg moeilijk te bestuderen is. De structuur van de TRPM8-sensor is ook relatief complex, samengesteld uit vier identieke kopieën van het eiwit dat wordt gecodeerd door het TRPM8-gen.

Voor dit project, Lander en co-eerste auteur Mengyu Wu, een afgestudeerde student in zijn laboratorium, in plaats daarvan gekozen voor het gebruik van cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM), een structuurbepalingsmethode die steeds meer de voorkeur heeft voor moeilijke structurele studies. Lee en zijn team begonnen met het screenen van TRPM8-eiwitten van meer dan een dozijn verschillende diersoorten, inclusief mensen, muizen, en vogels, om er een te vinden die zich waarschijnlijk het beste zou gedragen voor een cryo-EM-onderzoek. Ze vestigden zich op het TRPM8-eiwit van een vogel die de halsbandvliegenvanger wordt genoemd.

"Alle bewijzen wijzen erop dat de vliegenvanger TRPM8 op dezelfde manier werkt als zoogdieren TRPM8's, dus we zijn ervan overtuigd dat onze structurele analyse zich direct zal vertalen naar de menselijke vorm van deze sensor, ' zei Lander.

De wetenschappers werden geconfronteerd met veel hindernissen vanwege de inherente instabiliteit van TRPM8 buiten zijn oorspronkelijke membraanomgeving. "Zelfs binnen één dag na verzending van de monsters van Duke naar TSRI, het eiwitcomplex zou beginnen uiteen te vallen, " zei Wu. "Het Lee-lab heeft strategisch een paar stabiliserende mutaties aan het eiwit toegevoegd, zodat het minder vatbaar is voor afbraak." Ying Yin, een afgestudeerde student in het Lee laboratorium, ging ook terug en zorgvuldig gescreend door verschillende zuiveringsomstandigheden om extra stabiliteit aan het monster te verlenen.

Het eiwit gedroeg zich ook anders dan de meeste monsters waar het Lander-lab doorgaans aan werkt voor elektronenmicroscopie, en het kostte de onderzoekers meer dan een jaar om de juiste omstandigheden te identificeren om dit uitdagende biomolecuul in beeld te brengen.

"We moesten het rulebook weggooien en de gebruikelijke aanpak voor het oplossen van dit soort structuren heroverwegen. ' zei Lander.

Door deze aanpassingen de onderzoekers konden de eerste structurele glimp van TRPM8 opvangen met een algemene resolutie van ongeveer 4 Angstrom (0,4 miljardste van een meter). Het resulterende atoommodel bevatte ook enkele verrassingen. "Andere groepen hebben een hypothese opgesteld over de structuur van TRPM8 en hoe het interageert met bindende partners zoals menthol, maar wat we ontdekten was dat vrijwel al deze gefundeerde gissingen behoorlijk ver weg waren, " zei Lander. In het bijzonder, het bindzakje voor menthol bleek op een onverwachte plek te zitten, verschillend van de ligandbindingslocatie in andere TRP-sensoren.

"Een ding dat deze structuur ons vertelt, is dat TRP-sensoren niet allemaal op dezelfde manier werken, en dus verwacht ik dat we veel nieuwe sensormechanismen zullen ontdekken naarmate we meer van deze TRP-structuren bestuderen, ' zei Lander.

TRPM8 is onder meer interessant voor de farmaceutische industrie vanwege de pijnstillende, ontstekingsremmende effecten die het kan hebben wanneer het wordt geactiveerd. Bovendien, varianten van het gen zijn in verband gebracht met een aanleg voor migraine, en wetenschappers hebben aangetoond dat het manipuleren van TRPM8 migraine-achtige pijn bij dieren kan veroorzaken.

"TRPM8 komt ook abnormaal tot expressie in sommige prostaat, borst- en andere kankers, waardoor het een potentieel chemotherapeutisch doelwit wordt, ' zei Wu.

Hoewel TRPM8 vooral bekend is als een perifere zenuwsensor van matig koude temperaturen (beneden ongeveer 25°C) en van koudegevoelige moleculen zoals menthol, het wordt ook gevonden in veel andere normale weefsels, zelfs diep in het lichaam, en zijn functies in die weefsels blijven grotendeels onduidelijk. Een gedetailleerd begrip van de structurele interactie van TRPM8 met zijn natuurlijke bindingspartners zou moeten leiden tot de ontwikkeling van betere moleculaire sondes die wetenschappers kunnen helpen de verschillende functies ervan te onthullen.

De Lander en Lee Laboratoria werken nu aan een beter begrip van hoe TRPM8 interageert met menthol en andere therapeutische bindingspartnermoleculen.