Wetenschappers van het Broad Institute en MIT die CRISPR voor het eerst gebruikten voor het bewerken van het genoom van zoogdieren, hebben een nieuw moleculair systeem ontwikkeld voor het efficiënt bewerken van RNA in menselijke cellen. RNA-bewerking, die genproducten kunnen veranderen zonder veranderingen in het genoom aan te brengen, heeft een enorm potentieel als instrument voor zowel onderzoek als ziektebehandeling.

In een artikel dat vandaag is gepubliceerd in Wetenschap , senior auteur Feng Zhang en zijn team beschrijven het nieuwe op CRISPR gebaseerde systeem, genaamd RNA-editing voor programmeerbare A tot I-vervanging, of "REPARATIE". Het systeem kan enkele RNA-nucleosiden in zoogdiercellen op een programmeerbare en precieze manier veranderen. REPAIR heeft het vermogen om ziekteverwekkende mutaties op RNA-niveau om te keren, evenals andere potentiële therapeutische en fundamentele wetenschappelijke toepassingen.

"Het vermogen om ziekteverwekkende mutaties te corrigeren is een van de belangrijkste doelen van genoombewerking, " zei Zhang, een kerninstituutlid bij het Broad Institute en onderzoeker bij het McGovern Institute for Brain Research aan het MIT. "Tot dusver, we zijn erg goed geworden in het inactiveren van genen, maar eigenlijk is het herstellen van de verloren eiwitfunctie veel uitdagender. Deze nieuwe mogelijkheid om RNA te bewerken, opent meer potentiële mogelijkheden om die functie te herstellen en vele ziekten te behandelen, in bijna elke soort cel."

REPAIR heeft de mogelijkheid om individuele RNA-letters te targeten, of nucleosiden, adenosines omschakelen naar inosines (door de cel gelezen als guanosines). Deze letters zijn betrokken bij veranderingen op een enkele basis waarvan bekend is dat ze regelmatig ziekten bij mensen veroorzaken. Bij menselijke ziekten, een mutatie van G naar A komt zeer vaak voor; deze wijzigingen zijn betrokken bij, bijvoorbeeld, gevallen van focale epilepsie, Duchenne spierdystrofie, en de ziekte van Parkinson. REPAIR heeft het vermogen om de impact van elke pathogene G-naar-A-mutatie ongedaan te maken, ongeacht de omringende nucleotidesequentie, met het potentieel om in elk celtype te werken.

In tegenstelling tot de permanente veranderingen in het genoom die nodig zijn voor DNA-bewerking, RNA-bewerking biedt een veiliger, flexibelere manier om correcties in de cel aan te brengen. "REPAIR kan mutaties repareren zonder te knoeien met het genoom, en omdat RNA van nature afbreekt, het is een potentieel omkeerbare oplossing, " legde co-eerste auteur David Cox uit, een afgestudeerde student in het lab van Zhang.

Om REPARATIE aan te maken, de onderzoekers hebben de CRISPR-Cas13-enzymfamilie systematisch geprofileerd voor potentiële "editor" -kandidaten (in tegenstelling tot Cas9, de Cas13-eiwitten richten en knippen RNA). Ze selecteerden een enzym uit de Prevotella-bacterie, genaamd PspCas13b, die het meest effectief was bij het inactiveren van RNA. Het team ontwikkelde een gedeactiveerde variant van PspCas13b die nog steeds bindt aan specifieke stukken RNA, maar zijn "schaarachtige" activiteit mist. en fuseerde het tot een eiwit genaamd ADAR2, die de nucleoside adenosine verandert in inosine in RNA-transcripten.

In reparatie, het gedeactiveerde Cas13b-enzym zoekt een doelsequentie van RNA, en het ADAR2-element voert de nucleosideconversie uit zonder het transcript te snijden of te vertrouwen op een van de natieve machinerie van de cel.

Het team heeft het bewerkingssysteem verder aangepast om de specificiteit te verbeteren, het verminderen van detecteerbare off-target bewerkingen van 18, 385 tot slechts 20 in het hele transcriptoom. De verbeterde incarnatie, REPARATIEv2, bereikte consequent de gewenste bewerking in 20 tot 40 procent - en tot 51 procent - van een gericht RNA zonder tekenen van significante activiteit buiten het doel. "Het succes dat we hadden bij het ontwikkelen van dit systeem is bemoedigend, en er zijn duidelijke tekenen dat REPAIRv2 nog verder kan worden ontwikkeld voor meer robuuste activiteit met behoud van specificiteit, " zei Omar Abudayyeh, co-eerste auteur en een afgestudeerde student in het lab van Zhang.

Om het therapeutische potentieel van REPAIR aan te tonen, het team synthetiseerde de pathogene mutaties die Fanconi-anemie en X-gebonden nefrogene diabetes insipidus veroorzaken, introduceerde ze in menselijke cellen, en corrigeerde deze mutaties met succes op RNA-niveau. Om de therapeutische vooruitzichten verder te duwen, het team is van plan om de efficiëntie van REPAIRv2 te verbeteren en het te verpakken in een leveringssysteem dat geschikt is om REPAIRv2 in specifieke weefsels in diermodellen te introduceren.

De onderzoekers werken ook aan aanvullende tools voor andere soorten nucleosideconversies. "Er is een enorme natuurlijke diversiteit in deze enzymen, " zei co-eerste auteur Jonathan Gootenberg, een afgestudeerde student in zowel het laboratorium van Zhang als het laboratorium van Aviv Regev, lid van het brede kerninstituut. "We zijn altijd op zoek naar de kracht van de natuur om deze veranderingen door te voeren."

Zhang, samen met het Broad Institute en MIT, plan om het REPAIR-systeem op grote schaal te delen. Net als bij eerdere CRISPR-tools, de groepen zullen deze technologie vrij beschikbaar stellen voor academisch onderzoek via de pagina van het Zhang-lab op de website voor het delen van plasmiden Addgene, waardoor het Zhang-lab al meer dan 42 reagentia heeft gedeeld, 000 keer met onderzoekers op meer dan 2, 200 laboratoria in 61 landen, onderzoek over de hele wereld versnellen.