Echte beeldvorming met superresolutie voorbij de diffractielimiet blijft een grote uitdaging voor far-field Raman-microscopie, vooral in biologische toepassingen. Gebruikmakend van Stimulated Raman Excited Fluorescence (SREF) als een ultragevoelig trillingscontrast, een team van Columbia University heeft onlangs een nieuwe vibratiemicroscopie met superresolutie uitgevonden. Hun nieuwe methode opent superresolutie, nanometer-spectrale resolutie multicolor vibrationele beeldvorming van biologische systemen.

Het is een lang streven geweest om superresolutie-beeldvormingstechnieken voor Raman-microscopie te ontwikkelen, die intrinsieke voordelen heeft van chemische specificiteit ten opzichte van zijn fluorescentie-tegenhanger. Ondanks het gepercipieerde belang en de uitgebreide onderzoeksinspanningen, echte superresolutie (gedefinieerd als diffractie-onbeperkt) Raman-beeldvorming van biologische systemen in het optische verre veld blijft een uitdaging vanwege de tekortkoming in gevoeligheid voor conventionele Raman-verstrooiing. Bijgevolg, die gerapporteerde vibratiebeeldvormingsmethoden met superresolutie zijn gebaseerd op excitatieverzadiging, uitputtend, of hoge-orde niet-lineariteit van de Raman-overgangen. Deze vereisen extreem intens laservermogen om een ​​matige resolutieverbetering te bereiken (vaak minder dan een factor 2), die het nut ervan voor biologische toepassing remt.

In een nieuw artikel gepubliceerd in Licht:wetenschap en toepassingen , een team van wetenschappers, onder leiding van professor Wei Min van de Columbia University, VS, heeft een nieuwe vibratiemicroscopie met superresolutie ontwikkeld die gebruikmaakt van Stimulated Raman Excited Fluorescence (SREF) als een ultragevoelig vibratiecontrast. SREF koppelt de vibratie-excitatie aan fluorescentiedetectie en maakt Raman-spectroscopie over het hele veld mogelijk met een gevoeligheid tot op één molecuul. Echter, directe koppeling van gestimuleerde emissiedepletie (STED) met SREF-beeldvorming slaagt er niet in om beeldvorming met superresolutie te bereiken vanwege de aanwezigheid van de anti-stokes-fluorescentie-achtergrond, die niet kunnen worden uitgeput door de STED-straal.

In dit nieuwe werk het team bedacht een frequentiemodulatie (FM)-strategie om deze breedbandachtergrond te verwijderen. Door de excitatiefrequentie tijdelijk aan en uit te moduleren met de beoogde vibratieresonantie, maar nog steeds binnen de brede lijnbreedte van de achtergrond, ze kunnen een intensiteitsmodulatie genereren op het pure trillingssignaal (maar niet op de achtergrond). Het achtergrondvrije trillingssignaal kan vervolgens worden gedemoduleerd door een lock-in-detectie. In vergelijking met het typische ruwe SREF-spectrum, het spectrum verkregen door FM-SREF vertegenwoordigt het pure SREF-signaal, die contrastrijke achtergrondvrije SREF-beeldvorming mogelijk maakt. Ze synthetiseerden verder nieuwe isotoop-bewerkte SREF-kleurstoffen om meerkleurige FM-SREF biologische beeldvorming met scherp vibratiecontrast mogelijk te maken. Twee vibrerende kleuren worden gescheiden door FM-SREF met minimale overspraak, wat bijna onmogelijk is met conventionele fluorescentiemicroscopie. Een dergelijke chemische specificiteit van vibratiebeeldvorming heeft unieke voordelen voor gemultiplexte optische beeldvorming.

Eindelijk, door STED te integreren met achtergrondvrije FM-SREF, ze bereikten vibrerende beeldvorming met hoog contrast en superresolutie met STED-FM-SREF, waarvan de ruimtelijke resolutie alleen wordt bepaald door de signaal-ruisverhouding. Ze toonden een meer dan twee keer zo hoge resolutieverbetering aan in biologische systemen met een matig laserexcitatievermogen. Met toekomstige optimalisatie van de instrumentatie en beeldsondes, STED-FM-SREF-microscopie is bedoeld om een ​​breed scala aan biologische toepassingen te ondersteunen, met zijn uitstekende resolutie, hoge gevoeligheid, uniek vibratiecontrast, en biocompatibele excitatiekracht.