Fluorescentiemicroscopie wordt veel gebruikt in de biochemie en biowetenschappen omdat het wetenschappers in staat stelt om cellen en bepaalde verbindingen in en om hen heen direct te observeren. Fluorescerende moleculen absorberen licht binnen een specifiek golflengtebereik en zenden het vervolgens opnieuw uit op het langere golflengtebereik. Echter, de belangrijkste beperking van conventionele fluorescentiemicroscopietechnieken is dat de resultaten erg moeilijk kwantitatief te evalueren zijn; fluorescentie-intensiteit wordt significant beïnvloed door zowel experimentele omstandigheden als de concentratie van de fluorescerende stof. Nutsvoorzieningen, een nieuwe studie door wetenschappers uit Japan zal een revolutie teweegbrengen op het gebied van fluorescentie-levensduurmicroscopie.

Een manier om het conventionele probleem te omzeilen is om te focussen op de levensduur van de fluorescentie in plaats van op de intensiteit. Wanneer een fluorescerende stof wordt bestraald met een korte lichtflits, de resulterende fluorescentie verdwijnt niet onmiddellijk maar "vervalt" in de loop van de tijd op een manier die specifiek is voor die stof. De fluorescentie-levensduurmicroscopietechniek maakt gebruik van dit fenomeen, die onafhankelijk is van experimentele omstandigheden, om fluorescerende moleculen en veranderingen in hun omgeving te kwantificeren. Echter, fluorescentieverval is extreem snel, en gewone camera's kunnen het niet vastleggen. Hoewel in plaats daarvan een enkelpunts fotodetector kan worden gebruikt, het moet door het hele gebied van het monster worden gescand om van elk gemeten punt een compleet 2D-beeld te kunnen reconstrueren. Dit proces omvat beweging van mechanische stukken, die de snelheid van het vastleggen van afbeeldingen aanzienlijk beperkt.

In deze recente studie gepubliceerd in wetenschappelijke vooruitgang , het team van wetenschappers ontwikkelde een nieuwe benadering om levenslange fluorescentiebeelden te verkrijgen zonder de noodzaak van mechanisch scannen. Professor Takeshi Yasui, van Institute of Post-LED Photonics (pLED), Tokushima-universiteit, Japan, die de studie leidde, zegt, "Onze methode kan worden geïnterpreteerd als het gelijktijdig in kaart brengen van 44, 400 op licht gebaseerde 'stopwatches' over een 2D-ruimte om de levensduur van de fluorescentie te meten - allemaal in een enkele opname en zonder scannen."

Een van de belangrijkste pijlers van hun methode is het gebruik van een optische frequentiekam als excitatielicht voor het monster. Een optische frequentiekam is in wezen een lichtsignaal dat is samengesteld uit de som van vele discrete optische frequenties met een constante tussenruimte ertussen. Het woord "kam" verwijst in deze context naar hoe het signaal eruitziet wanneer het wordt uitgezet tegen de optische frequentie:een dichte cluster van op gelijke afstanden staande pieken die oprijzen vanaf de optische frequentie-as en die lijken op een haarkam. Met behulp van speciale optische apparatuur, een paar excitatiefrequentiekamsignalen wordt ontleed in individuele optische beatsignalen (dual-comb optische beats) met verschillende intensiteitsmodulatiefrequenties, elk met een enkele modulatiefrequentie en bestraald op het doelmonster. De sleutel hier is dat elke lichtstraal het monster op een ruimtelijk verschillende locatie raakt, het creëren van een één-op-één correspondentie tussen elk punt op het 2D-oppervlak van het monster (pixel) en elke modulatiefrequentie van de dual-comb optische beats.

Vanwege de fluorescentie-eigenschappen het monster zendt een deel van de opgevangen straling opnieuw uit terwijl de frequentie-positie-correspondentie behouden blijft. De fluorescentie die door het monster wordt uitgezonden, wordt vervolgens eenvoudig met een lens gefocusseerd op een snelle enkelpunts fotodetector. Eindelijk, het gemeten signaal wordt wiskundig omgezet in het frequentiedomein, en de fluorescentielevensduur bij elke "pixel" kan gemakkelijk worden berekend uit de relatieve fasevertraging die bestaat tussen het excitatiesignaal bij die modulatiefrequentie versus de gemeten frequentie.

Dankzij de superieure snelheid en hoge ruimtelijke resolutie, de microscopiemethode die in deze studie is ontwikkeld, zal het gemakkelijker maken om de voordelen van fluorescentielevensduurmetingen te benutten. "Omdat onze techniek niet hoeft te worden gescand, bij elke opname is een gelijktijdige meting over het gehele monster gegarandeerd, " zegt prof. Yasui, "Dit zal nuttig zijn in de biowetenschappen waar dynamische observaties van levende cellen nodig zijn." Naast een dieper inzicht in biologische processen, deze nieuwe aanpak kan worden gebruikt voor gelijktijdige beeldvorming van meerdere monsters voor antigeentests, die al wordt gebruikt voor de diagnose van COVID-19.

Misschien wel het belangrijkste, deze studie laat zien hoe optische frequentiekammen, die alleen werden gebruikt als "frequentie heersers, " kan een plaats vinden in microscopietechnieken om de grenzen in de biowetenschappen te verleggen. Het is veelbelovend voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische opties om hardnekkige ziekten te behandelen en de levensverwachting te verhogen, daardoor de hele mensheid ten goede komen.