Een belangrijk samenwerkingsverband dat zich de afgelopen drie jaar heeft ontwikkeld tussen ASU en Europese wetenschappers, heeft geleid tot een aanzienlijke technische vooruitgang in röntgenkristallografische monsterstrategieën.

De ASU-bijdrage is afkomstig van de School of Molecular Sciences (SMS), afdeling natuurkunde en het Biodesign Institute Center for Applied Structural Discovery.

De European X-ray Free Electron Laser (EuXFEL) is een onderzoeksfaciliteit van superlatieven:het genereert ultrakorte röntgenpulsen-27, 000 keer per seconde en met een helderheid die een miljard keer hoger is dan die van de beste conventionele röntgenstralingsbronnen. Na tien jaar bouwen, het ging eind 2017 open voor de eerste experimenten. De groep van Alexandra Ros, professor in ASU's SMS kreeg de tweede toewijzing van straaltijd onder wereldwijde concurrenten.

hun resultaten, gepubliceerd op 9 september in Natuurcommunicatie , gevalideerde een unieke microfluïdische druppelgenerator voor het verminderen van de steekproefomvang en afval (dat kan oplopen tot 99 procent) in de Serial Femtosecond Crystallography (SFX) -experimenten van haar team. Met behulp van dit, ze bepaalden de kristalstructuur van het enzym 3-Deoxy-d-manno-Octulosonate 8-Phosphate Synthase (KDO8PS) en onthulden nieuwe details in een voorheen ongedefinieerd lusgebied van het enzym dat een potentieel doelwit is voor antibioticastudies.

"We zijn verheugd dat dit werk, resultaat van een enorme samenwerking, is goed ontvangen in de XFEL-gemeenschap, " legde Ros uit. "We zijn deze methode verder aan het ontwikkelen en zoeken naar synchronisatie van de microfluïdische druppeltjes met de pulsen van XFEL's. Op dit moment, een klein team van ASU-studenten is net klaar met het uitvoeren van experimenten bij de Linac Coherent Light Source (LCLS) in het SLAC National Accelerator Laboratory in Menlo Park, CA om de methode te verfijnen. Er had geen betere timing kunnen zijn voor de publicatie van ons werk."

SLAC is de XFEL-faciliteit geweest die het best bekend is bij Amerikaanse wetenschappers, waar het nu beroemde werk aan de kristallografie van eiwitnanokristallen (door het ASU-team onder leiding van professoren John Spence en Petra Fromme) werd uitgevoerd. SLAC en zijn metgezel in Europa, ook in Hamburg, zeer succesvol zijn geweest en daarom zijn zwaar overboekt. De ingebruikname van de nieuwe faciliteit, met zijn gigantische versnellertunnel van 2,6 mijl en resolutie op atoomlengteschaal, heeft een deel van de vraag naar de andere faciliteiten verlicht, terwijl het grote nieuwe mogelijkheden biedt in de natuurwetenschappen.

SFX is een veelbelovende techniek voor het bepalen van de eiwitstructuur, waar een vloeistofstroom met eiwitkristallen wordt doorsneden met een XFEL-straal met hoge intensiteit die een miljard keer helderder is dan traditionele synchrotron-röntgenbronnen.

Hoewel de kristallen worden vernietigd door de intense XFEL-straal onmiddellijk nadat ze zijn afgebogen, de diffractie-informatie kan, opmerkelijk, nog steeds geregistreerd dankzij de state-of-the-art detectoren. Er zijn krachtige nieuwe data-analysemethoden ontwikkeld, waardoor een team deze diffractiepatronen kan analyseren en elektronendichtheidskaarten en gedetailleerde structurele informatie van eiwitten kan verkrijgen.

De methode is vooral aantrekkelijk voor moeilijk te kristalliseren eiwitten, zoals membraaneiwitten, omdat het structurele informatie met een hoge resolutie oplevert van micro- en zelfs nanokristallen, waardoor de bijdrage van kristaldefecten wordt verminderd en de vervelende (zo niet onmogelijke) groei van de grote kristallen wordt vermeden die vereist zijn door traditionele op synchrotron gebaseerde kristallografie.

Hoewel kristallografie met XFEL's een krachtige techniek is geweest om de structuren van grote eiwitcomplexen te ontrafelen en ook tijdsopgeloste kristallografie mogelijk te maken, deze geavanceerde wetenschap brengt niettemin een groot probleem met zich mee. Vanwege de kleine "hit"-snelheid vereist het enorme hoeveelheden gesuspendeerd eiwit, die, hoewel niet bestraald, zijn omslachtig om op te halen voor de meeste eiwitmonsters. Maar liefst 99% van het eiwit kan worden verspild.

Hierin ligt de grote technische vooruitgang van Ros en haar team. Ze hebben een 3D-geprint microfluïdisch apparaat ontwikkeld, dat is een hoge resolutie, en genereert waterige-in-oliedruppeltjes met variabele druppelsegmentatie die kunnen worden gesynchroniseerd met de vrije elektronenlaserpulsen. Dit vermindert drastisch de hoeveelheid gezuiverd eiwit die nodig is voor het Europese XFEL-experiment van de momenteel typische (en bijna ontoegankelijke) vereiste van 1 g voor het opnemen van volledige gegevenssets.

Het belang van deze ontwikkeling moet worden herhaald. De benadering van de onderzoekers plaatst met monsters beladen vloeibare "slakken" in een offervloeistof, zodat een snel bewegende vloeibare microjet wordt gehandhaafd met het monster alleen aanwezig tijdens blootstelling aan de femtoseconde XFEL-pulsen (duur van een miljoenste van een miljardste van een seconde).

Het team van wetenschappers heeft de druppelgeneratie van het enzym KDO8PS-kristalsuspensies aangetoond met de microfluïdische druppelgenerator en aangetoond dat de druppelgeneratiefrequentie kan worden geregeld door de snelheden van de water- en oliestromen. De diffractiekwaliteit van de kristallen van KDO8PS is vergelijkbaar, zowel wanneer ze worden geïnjecteerd in waterige druppeltjes omgeven door olie of door continue injectie met een Gas Dynamic Virtual Nozzle (GDVN), met ~ 60% vermindering van het monsterverbruik bereikt met druppelinjectie.

De vastgestelde structuur onthulde nieuwe details in een voorheen ongedefinieerd lusgebied van KDO8PS, een potentieel doelwit voor antibioticastudies. Deze resultaten pleiten voor toekomstige routinematige integratie van druppelgeneratie door gesegmenteerde oliestroom bij andere XFEL's over de hele wereld.