science >> Wetenschap >  >> Fysica

Kijken met elektronen:wetenschappers effenen de weg naar meer betaalbare en toegankelijke cryo-EM

Onderzoekers van de QWM-eenheid, Dr. Hidehito Adaniya (links) en Dr. Martin Cheung (rechts) tonen de nieuwe cryo-elektronenmicroscoop. Krediet:Okinawa Instituut voor Wetenschap en Technologie

De structuur van virussen visualiseren, eiwitten en andere kleine biomoleculen kunnen wetenschappers helpen om dieper inzicht te krijgen in hoe deze moleculen functioneren, mogelijk leidend tot nieuwe behandelingen voor ziekten. In recente jaren, een krachtige technologie genaamd cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM), waar flash-bevroren monsters zijn ingebed in glasachtig ijs en onderzocht door een elektronenstraal, heeft een revolutie teweeggebracht in de beeldvorming van biomoleculen. Echter, de microscopen waarop de techniek vertrouwt, zijn onbetaalbaar en ingewikkeld in gebruik, waardoor ze voor veel onderzoekers ontoegankelijk zijn.

Nutsvoorzieningen, wetenschappers van de Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University (OIST) hebben een goedkopere en gebruiksvriendelijkere cryo-elektronenmicroscoop ontwikkeld, waardoor cryo-EM uiteindelijk in het bereik van duizenden laboratoria zou kunnen komen.

In een bouwproces van zes jaar het team bouwde de microscoop door een nieuwe beeldvormingsfunctie toe te voegen aan een scanning elektronenmicroscoop. Ze gebruikten de hybride microscoop om drie verschillende biomoleculen in beeld te brengen:twee duidelijk gevormde virussen en een regenwormeiwit.

"Het bouwen van deze microscoop was een lang en uitdagend proces, dus we zijn enthousiast over de resultaten tot nu toe, " zei Dr. Hidehito Adaniya, een onderzoeker in de Quantum Wave Microscopy (QWM) Unit en co-eerste auteur van de studie, gepubliceerd in Ultramicroscopie . "Behalve dat het goedkoper en gebruiksvriendelijker is, onze microscoop maakt gebruik van laagenergetische elektronen, wat het contrast van de afbeeldingen mogelijk zou kunnen verbeteren."

Momenteel, cryo-EM werkt door hoogenergetische elektronen af ​​te vuren op een biologisch exemplaar. De elektronen interageren met atomen in het biomolecuul en verstrooien, hun richting veranderen. De verstrooide elektronen raken dan detectoren, en het specifieke spreidingspatroon wordt gebruikt om een ​​afbeelding van het monster op te bouwen.

De twee conventionele modi van een scanning elektronenmicroscoop (SEM en STEM; links en midden) waren niet in staat om beelden van de biomoleculen te genereren. Echter, holografische beeldmodus (rechts), kan worden gebruikt om biomoleculen in beeld te brengen, zoals het getoonde tabaksmozaïekvirus. Krediet:gewijzigd van M Cheung, H Adaniya, C Cassidy, Mijn Yamashita, T Shintake. Low-energy in-line elektron holografische beeldvorming van glasachtig ijs ingebedde kleine biomoleculen met behulp van een gemodificeerde scanning elektronenmicroscoop. Ultramicroscopie, 209 (2020) 112883, Afb 3.

Maar bij hoge energieën, slechts een relatief klein aantal van deze verstrooiingsgebeurtenissen vindt plaats omdat de elektronen zeer zwak interageren met de atomen in het monster terwijl ze voorbijsnellen.

"Biomoleculen zijn voornamelijk samengesteld uit elementen met een lage atomaire massa, zoals koolstof, stikstof, waterstof en zuurstof, " verklaarde co-auteur en onderzoeker, Dr. Martin Cheung. "Deze lichtere elementen zijn praktisch onzichtbaar voor snelle elektronen."

In tegenstelling tot, laagenergetische elektronen reizen langzamer en interageren sterker met de lichtere elementen, het creëren van meer frequente verstrooiingsgebeurtenissen.

Deze sterke interactie tussen laagenergetische elektronen en lichtere elementen is een uitdaging om te benutten, echter, omdat de ijslaag rond het preparaat ook elektronen verstrooit, het creëren van achtergrondgeluid dat de biomoleculen maskeert. Om dit probleem op te lossen, de wetenschappers pasten de microscoop aan zodat hij kon overschakelen naar een andere beeldvormingstechniek:cryo-elektronenholografie.

In de holografische beeldmodus, de elektronenbundel omvat het hele monster, een referentiegolf en een objectgolf vormen. Deze golven interfereren dan met elkaar om een ​​hologram te vormen, die wordt geregistreerd door een detector. Krediet:gewijzigd van M Cheung, H Adaniya, C Cassidy, Mijn Yamashita, T Shintake. Low-energy in-line elektron holografische beeldvorming van glasachtig ijs ingebedde kleine biomoleculen met behulp van een gemodificeerde scanning elektronenmicroscoop. Ultramicroscopie, 209 (2020) 112883, Figuur 2.

Het hologram vormen

In holografische modus, een elektronenkanon vuurt een bundel laagenergetische elektronen af ​​op het monster, zodat een deel van de elektronenbundel door het ijs en het monster gaat, een objectgolf vormen, terwijl het andere deel van de elektronenbundel alleen door het ijs gaat, een referentiegolf vormen. De twee delen van de elektronenbundel interageren dan met elkaar, als botsende rimpelingen in een vijver, het creëren van een duidelijk interferentiepatroon - het hologram.

Gebaseerd op het interferentiepatroon van het hologram, de detectoren kunnen verstrooiing door het monster onderscheiden van verstrooiing door de ijsfilm. Wetenschappers kunnen de twee delen van de bundel ook vergelijken om extra informatie van de elektronen te krijgen die moeilijk te detecteren is met conventionele cryo-EM.

"Elektronenholografie biedt ons twee verschillende soorten informatie - amplitude en fase - terwijl conventionele cryo-elektronenmicroscopietechnieken alleen fase kunnen detecteren, " zei Dr. Adaniya. Deze toegevoegde informatie zou wetenschappers in staat kunnen stellen meer kennis op te doen over de structuur van het specimen, hij legde uit.

Kristallijn ijs vormt zich wanneer atmosferische waterdamp afkoelt en kristalliseert bij contact met het onderkoelde monster. De onderzoekers moeten daarom de voorbereidingsprocedure uitvoeren in een met stikstof gevulde handschoenkast om elk contact met water te voorkomen. Krediet:Okinawa Instituut voor Wetenschap en Technologie

Een doorbraak in dun ijs

Naast het bouwen van de hybride microscoop, de wetenschappers moesten ook de monstervoorbereiding optimaliseren. Omdat elektronen met lage energie sneller door het ijs worden verstrooid dan elektronen met hoge energie, de ijsfilm die het monster omhulde moest zo dun mogelijk zijn om het signaal te maximaliseren. De wetenschappers gebruikten vlokken gehydrateerd grafeenoxide om de biomoleculen op hun plaats te houden. waardoor dunnere ijsfilms kunnen worden gevormd.

De wetenschappers moesten ook speciale maatregelen nemen om de vorming van kristallijn ijs te voorkomen, wat "slecht nieuws is voor cryo-EM-beeldvorming, ' zei Cheung.

Met de huidige opzet en geoptimaliseerde samples, de microscoop maakte beelden met een resolutie tot enkele nanometers, waarvan de onderzoekers erkennen dat het veel lager is dan de bijna-atomaire resolutie die wordt bereikt door conventionele cryo-EM.

Maar zelfs met de huidige resolutie, de microscoop vult nog steeds een belangrijke niche als pre-screening microscoop. "Omdat de laagenergetische elektronen zo sterk interageren met het ijs, onze goedkopere en gebruiksvriendelijke microscoop kan onderzoekers helpen hun ijskwaliteit te meten voordat ze kostbare tijd en geld besteden aan het gebruik van conventionele cryo-EM-microscopen, " zei dr. Adaniya.

Het hele proces is snel en eenvoudig, zeggen de onderzoekers. De SEM/STEM-modus helpt wetenschappers bij het vinden van de beste plek voor beeldvorming, gevolgd door een naadloze overgang naar de holografische modus. Bovendien, de mogelijkheid om deze modusomschakeltechnologie te implementeren in andere commerciële scanning-elektronenmicroscopen maakt het een algemeen aanvaardbare beeldvormingsmethode.

In de toekomst, het team hoopt de beeldresolutie verder te verbeteren, door het elektronenkanon te veranderen in een kanon dat een elektronenstraal van hogere kwaliteit creëert. "Dat wordt de volgende stap voorwaarts, " ze zeiden.