Superresolutiemicroscopie is een techniek die verder kan dan de diffractie van licht, biedt ongekende weergaven van cellen en hun interne structuren en organellen. De techniek staat de laatste tijd steeds meer in de belangstelling, vooral sinds de ontwikkelaars in 2014 de Nobelprijs voor Scheikunde wonnen.

Maar superresolutiemicroscopie heeft een grote beperking:het biedt alleen ruimtelijke resolutie. Dat zou kunnen volstaan ​​voor statische monsters, zoals vaste materialen of vaste cellen, maar als het om biologie gaat, dingen worden ingewikkelder. Levende cellen zijn zeer dynamisch en zijn afhankelijk van een complexe reeks biologische processen die plaatsvinden op tijdschalen van minder dan een seconde, Steeds veranderend. Dus als we willen visualiseren en begrijpen hoe levende cellen functioneren bij gezondheid en ziekte, we hebben ook een hoge tijd (of "tijdelijke") resolutie nodig.

Een team onder leiding van professor Theo Lasser, het hoofd van het Laboratorium voor Biomedische Optica (LOB) bij EPFL heeft nu stappen gezet om het probleem aan te pakken door een techniek te ontwikkelen die zowel 3D-superresolutiemicroscopie als snelle 3D-fasebeeldvorming in een enkel instrument kan uitvoeren. Fasebeeldvorming is een techniek die de veranderingen in de lichtfase veroorzaakt door cellen en hun organellen vertaalt in brekingsindexkaarten van de cellen zelf.

Het unieke platform, die wordt aangeduid als een 4-D-microscoop, combineert de gevoeligheid en hoge tijdresolutie van fasebeeldvorming met de specificiteit en hoge ruimtelijke resolutie van fluorescentiemicroscopie. De onderzoekers ontwikkelden een nieuw algoritme dat de fase-informatie kan herstellen van een stapel helderveldbeelden gemaakt door een klassieke microscoop.

"Met dit algoritme we presenteren een nieuwe manier om 3-D kwantitatieve fasemicroscopie te bereiken met behulp van een conventionele helderveldmicroscoop, " zegt Adrien Descloux, een van de hoofdauteurs van het artikel. "Dit maakt directe visualisatie en analyse van subcellulaire structuren in levende cellen mogelijk zonder labeling."

Om snelle 3D-beeldvorming te bereiken, de wetenschappers op maat een beeldsplitsend prisma hebben ontworpen, waarmee de gelijktijdige opname van een stapel van acht z-verplaatste afbeeldingen mogelijk is. Dit betekent dat de microscoop high-speed 3D-fasebeeldvorming kan uitvoeren over een volume van 2,5 m x 50 m x 50 m. De snelheid van de microscoop wordt in principe beperkt door de snelheid van zijn camera; voor deze demonstratie het team was in staat om intracellulaire dynamiek tot 200 Hz in beeld te brengen. "Met het prisma als add-on, je kunt van een klassieke microscoop een ultrasnelle 3D-imager maken, " zegt Kristin Grussmayer, nog een van de hoofdauteurs van het artikel.

Het prisma is ook geschikt voor 3D fluorescentiebeeldvorming, die de wetenschappers hebben getest met behulp van optische fluctuatiebeeldvorming met superresolutie (SOFI). Deze methode maakt gebruik van het knipperen van fluorescerende kleurstoffen om de 3D-resolutie te verbeteren door middel van correlatieanalyse van het signaal. Met behulp van dit, de onderzoekers voerden 3D-beeldvorming met superresolutie uit van gekleurde structuren in de cellen, en combineerde het met 3D-labelvrije fasebeeldvorming. De twee technieken vulden elkaar goed aan, onthullende fascinerende beelden van de innerlijke architectuur, cytoskelet, en organellen ook in levende cellen op verschillende tijdstippen.

"We zijn enthousiast over deze resultaten en de mogelijkheden die deze techniek biedt, " zegt professor Hilal Lashuel, wiens lab bij EPFL samenwerkte met Professor Lasser's bij het gebruik van de nieuwe techniek om de mechanismen te bestuderen waarmee eiwitaggregatie bijdraagt ​​aan de ontwikkeling en progressie van neurodegeneratieve ziekten, zoals Parkinson en Alzheimer. "De technische vooruitgang maakte visualisatie met hoge resolutie mogelijk van de vorming van pathologische alfa-synucleïne-aggregaten in hippocampale neuronen."

Het team heeft het nieuwe microscopieplatform PRISM, voor Phase Retrieval Instrument met superresolutiemicroscopie. "We bieden PRISM aan als een nieuw microscopie-instrument en verwachten dat het snel zal worden gebruikt in de life science-gemeenschap om de mogelijkheden voor 3D-beeldvorming met hoge snelheid voor biologisch onderzoek uit te breiden, " zegt Theo Lasser. "We hopen dat het een vast werkpaard wordt voor neurowetenschappen en biologie."