Eiwitten zijn de instrumenten van het leven. In de toekomst, wetenschappers kunnen afzonderlijke moleculen onderzoeken met een bijzonder zachte methode om te bepalen hoe ze zijn geconstrueerd, hoe ze hun functies in cellen uitoefenen, en hoe ze omgaan met potentiële medicijnen. Dit is mogelijk dankzij hologrammen van eiwitten die, Voor de eerste keer, hebben geproduceerd met behulp van zeer langzame elektronen door wetenschappers van de Universiteit van Zürich en het Max Planck Institute for So lid State Research in Stuttgart.

Het kennen van de structuur van eiwitten is niet alleen interessant voor biologen die willen begrijpen hoe een organisme werkt, maar ook voor artsen en farmacologen die willen weten hoe eiwitten worden opgebouwd, hoe ze interageren met andere eiwitten en kleinere moleculen, en hoe die bindingsplaatsen veranderen als het eiwit zijn functies vervult. Met deze kennis, onderzoekers kunnen medicijnen ontwikkelen die interageren met de eiwitmachinerie wanneer deze kapot gaat en we ziek worden.

De mogelijkheid om afzonderlijke eiwitten in beeld te brengen kan zeer nuttig zijn:voor gebruikelijke methoden zoals röntgenstructuuranalyse en cryo-elektronenmicroscopie zijn kristallen van de biomoleculen of een grote hoeveelheid van een eiwit nodig. Een tekortkoming van deze methoden is dat kristallen van veel eiwitten onmogelijk kunnen groeien. Bovendien, vanwege het gemiddelde, de technieken slagen er vaak niet in om verschillen tussen verschillende conformaties te detecteren, d.w.z. structurele varianten, van het biomolecuul. Toch zijn het juist deze variaties die belangrijk zijn in de zoektocht naar nieuwe medicijnen, omdat eiwitten verschillende conformaties aannemen wanneer ze hun functies uitvoeren.

Het oorspronkelijke idee van holografie is nu realiteit

"We hebben nu voor het eerst afzonderlijke eiwitten in beeld gebracht, " zegt Hans-Werner Fink, professor aan de Universiteit van Zürich en hoofd van het experiment. "Dit werd bereikt door twee methoden te combineren die uniek zijn in de wetenschappelijke wereld:elektronenholografie en elektrospray-ionenbundeldepositie, waardoor monsters heel voorzichtig kunnen worden bereid." Door deze combinatie te gebruiken, de onderzoekers hebben hologrammen gemaakt van cytochroom C, albumine en hemoglobine. Omdat de structuren van deze eiwitten al bekend zijn, de onderzoekers konden ze gebruiken om de nauwkeurigheid en bruikbaarheid van de hologrammen te bevestigen.

Voor elektronenholografie, de onderzoekers van Hans-Werner Fink's groep in Zürich hebben een innovatieve microscoop ontwikkeld die de golfeigenschappen van elektronen benut. De microscoop straalt laagenergetische elektronen uit door een eiwit en legt de verstrooide elektronen op het deel van de elektronenbundel dat geen interactie heeft gehad met het eiwit. Het resulterende interferentiepatroon, die door de microscoop kan worden vastgelegd, vormt een hologram vergelijkbaar met die verkregen door optische holografie. "Omdat de elektronen heel weinig energie hebben, er is zeer weinig stralingsschade, zelfs als we ons een eiwit urenlang voorstellen, in tegenstelling tot andere structurele analysemethoden, " legt Hans-Werner Fink uit.

Met de elektronenholografiemicroscoop, de natuurkundige heeft het oorspronkelijke idee van Dennis Gábor gerealiseerd. Toen de Hongaars-Britse ingenieur holografie uitvond in 1947, hij had eigenlijk een verbeterde elektronenmicroscoop in gedachten. Echter, destijds waren er geen geschikte elektronenbronnen, zodat, na de uitvinding van de laser, dit nieuwe principe van optische beeldvorming kon alleen met licht in de praktijk worden gebracht. Dennis Gábor ontving in 1971 de Nobelprijs voor Natuurkunde. "Na de uitvinding van een ultrascherpe elektronenpuntbron, die elektronen uitzendt met vergelijkbare eigenschappen als laserlicht, realiseerden we eindelijk het briljante idee van Dennis Gábor met elektronengolven, ", zegt Hans-Werner Fink.

Het gasvormige eiwit wordt voorzichtig op grafeen geplaatst

Echter, om afzonderlijke eiwitten in beeld te brengen met elektronenholografie, de Zwitserse onderzoekers hadden nog een dragermateriaal nodig voor de eiwitten dat transparant is voor elektronengolven en een methode om er biomoleculen op te plaatsen zonder schade aan te richten. Grafeen bleek het meest geschikte materiaal voor de drager. Onderzoekers van het Max Planck Institute for Solid State Research hebben de beste oplossing gevonden voor het afzetten van eiwitten op de platen bestaande uit koolstoflagen:elektrospray-ionenbundeldepositie, die werd ontwikkeld door een team onder leiding van Stephan Rauschenbach op de afdeling van Klaus Kern. De onderzoekers stellen de eiwitoplossing bloot aan een hoge elektrische spanning waardoor de vloeistof sterk geladen wordt. Elektrische afstoting zorgt er vervolgens voor dat de vloeistof vernevelt tot een fijne nevel. Wanneer de neveldruppels worden blootgesteld aan een vacuüm, de vloeistof verdampt en de opgeloste bestanddelen, d.w.z. eiwitten en onzuiverheden, als gassen achterblijven. Een massaspectrometer sorteert vervolgens de eiwitten op basis van hun massa-tot-ladingverhoudingen en scheidt ook onzuiverheden.

"Onze methode maakt het mogelijk om afzonderlijke biologische moleculen in het vacuüm over te brengen en ze zo voorzichtig op een oppervlak af te zetten dat hun fragiele driedimensionale gevouwen eiwitstructuur behouden blijft, ", zegt Stephan Rauschenbach. "Dankzij preparatieve massaspectrometrie, we voorkomen ook besmetting van de grafeenmonsters met andere moleculen, wat cruciaal is voor de kwaliteit van het holografische beeld." Massaspectrometrie maakt het ook mogelijk om eiwitmengsels of pure eiwitten te scheiden van complexen met bindingspartners.

Informatie over de assemblage van subeenheden

Zodra Stephan Rauschenbach en zijn collega's de eiwitten op de grafeensubstraten in Stuttgart hebben gedeponeerd, de monsters moeten naar Zürich worden vervoerd, waar de elektronenholografische microscoop zich bevindt. De monsters moeten in onbesmette staat aankomen, wat betekent dat er geen andere moleculen op het grafeen mogen neerslaan. Om de monsters naar Zwitserland te vervoeren, hebben de onderzoekers een casus ontwikkeld waarin een ultrahoog vacuüm heerst, zoals in het apparaat zelf.

Niet in de laatste plaats dankzij de nauwgezette zorg en netheid die tijdens de voorbereiding en het transport van de monsters worden waargenomen, elektronenhologrammen halen al een resolutie van minder dan een nanometer. "Hierdoor kunnen we onderzoeken hoe de afzonderlijke subeenheden van grote eiwitcomplexen worden geassembleerd, ", zegt Stephan Rauschenbach. De eerste hologrammen van afzonderlijke eiwitten geven ook informatie over hun driedimensionale structuur.

"Echter, om eiwitstructuren op atomair niveau nauwkeurig in beeld te brengen, we moeten de resolutie nog iets verbeteren, " legt Klaus Kern uit. ", er zijn geen fysieke obstakels die dit verhinderen.” De wetenschappers uit Zürich en Stuttgart zijn nu van plan om een ​​microscoop te bouwen waarin de trillingen van eiwitten worden onderdrukt door de monsters af te koelen tot ongeveer min 200 graden Celsius. er is onlangs een uniek precisielaboratorium gebouwd aan het Max Planck Instituut in Stuttgart, die perfecte omstandigheden biedt voor zeer gevoelige metingen zoals holografie. Dit laboratorium is gebouwd op initiatief van Klaus Kern en is momenteel de gouden standaard voor een trillingsarme meetomgeving. Zodra de elektronenholografiemicroscoop is geoptimaliseerd, biomedische wetenschappers kunnen dit nieuwe instrument gebruiken om de fijne kneepjes van het functioneren van de levensinstrumenten te bestuderen.