Onderzoekers van Kanazawa University rapporteren in Communications Biology dat het gebruik van gewone chemicaliën voor het fixeren van levende celmonsters voor microscopiestudies ervoor zorgt dat membraaneiwitten aggregeren.

Voor histologisch onderzoek van biologische weefsels, d.w.z. anatomische studies onder de microscoop, worden monsters meestal gefixeerd om te voorkomen dat ze vervallen. Fixatie wordt meestal gedaan door het monster onder te dompelen of te perfuseren in een chemische stof - aldehyden en alcoholen zijn gebruikelijke fixeermiddelen. Er is gespeculeerd dat membraaneiwitten die tot op zekere hoogte op een celmembraan bewegen, aggregaten kunnen vormen tijdens fixatie. Toch zijn gedetailleerde celoppervlakstudies met de resolutie op nanometerschaal nodig om definitieve inzichten in dit potentiële probleem te verkrijgen. Nu hebben Takehiko Ichikawa en collega's van de Kanazawa University atomaire krachtmicroscopie (AFM) -onderzoeken uitgevoerd op levende zoogdierceloppervlakken. Door niet-gefixeerde en gefixeerde monsters te vergelijken, ontdekten ze dat fixatie inderdaad tot structurele veranderingen leidt.

De onderzoekers ontwikkelden een methode voor het gebruik van microporeus siliciumnitridemembraan (MPM), gebruikt in transmissie-elektronenmicroscopie (Figuur 1), voor AFM-beeldvorming. Belangrijk is dat MPM het celoppervlak vlak kan maken en fluctuaties kan voorkomen door het gebied buiten het observatiegebied te ondersteunen. In AFM-beelden van de oppervlakken van de gekweekte darmkankercellen op MPM kwamen biomoleculaire structuren op de celmembranen naar voren als uitsteeksels met een typische grootte van enkele nanometers (Figuur 2 levend celoppervlak).

Toen de cellen werden behandeld met veelgebruikte fixeermiddelen zoals paraformaldehyde, glutaaraldehyde en methanol, verdwenen enkele nanometerstructuren en werden alleen grote uitsteeksels met een diameter van 20 tot 100 nanometer waargenomen (Figuur 2). De onderzoekers voerden verschillende fluorescentie-experimenten uit en concludeerden dat grote uitsteeksels die na fixatie werden waargenomen, werden gevormd door de aggregatie van membraaneiwitten.

De studie toont aan dat de waargenomen aggregaten artefacten zijn die het resultaat zijn van het fixatieproces. Dit zou voorzichtigheid moeten oproepen bij de gemeenschap van onderzoekers die met chemische fixeermiddelen werken. Ichikawa en collega's citeren:"Onderzoekers die clusters op nanoschaal observeren, moeten ook voorzichtig zijn bij het interpreteren van hun experimentele resultaten bij het gebruik van vaste cellen. We raden onderzoekers aan zoveel mogelijk levende cellen te gebruiken om het effect van fixatie te vermijden bij het onderzoeken van clusters op nanoschaal."

Het algemene principe achter atomaire krachtmicroscopie (AFM) is om een ​​zeer kleine tip het oppervlak van een monster te laten scannen. Tijdens deze horizontale (xy) scan volgt de punt, die aan een kleine cantilever is bevestigd, het verticale (z) profiel van het monster, waardoor een kracht op de cantilever wordt opgewekt die kan worden gemeten. De grootte van de kracht op de xy-positie kan worden gerelateerd aan de z-waarde; de xyz-gegevens die tijdens een scan worden gegenereerd, resulteren vervolgens in een hoogtekaart die structurele informatie geeft over het onderzochte monster. AFM wordt niet beïnvloed door de diffractielimiet vanwege het gebruik van licht of elektronenstralen en kan de intacte oppervlaktetopografie met hoge resolutie waarnemen. + Verder verkennen

Bewegende kenmerken toewijzen in snelle atoomkrachtmicroscopie