De gramkleuring is een differentiële kleuringsprocedure die laat zien welke bacteriën grampositief of gramnegatief zijn op basis van hun kleurvlek. Acetonalcohol is een reagens dat in dit proces wordt gebruikt om de kleurdifferentiatie te verschaffen. Grampositieve bacteriën hebben een dikke peptidoglycaanlaag en kleuren paars, terwijl gramnegatieve micro-organismen een weinig tot geen peptidoglycaanlaag hebben en roze kleuren.

Primaire Vlek-Kristalviooltje

Zodra een dia van bacteriemonster wordt bereid, kristal violet wordt gebruikt om het monster eerst te kleuren. Op dit moment zullen zowel grampositieve als gramnegatieve bacteriën paars lijken. Gewoonlijk wordt het kristalviolet gedurende 30 seconden op de schuif aangebracht voordat alle overtollige vlekken met water worden afgespoeld. Het kristalviolet kan een beetje hechten aan de peptidoglycaanlagen, dus niet alle primaire vlek zal worden weggewassen met het water.

Mordant-jodium

Jodium wordt dan één minuut aan het monster toegevoegd . Het werkt als een beitsmiddel, dat dient om kleurstoffen in een kleuringsproces te fixeren. Jodium voert deze functie uit door te binden aan het kristalviolet en een onoplosbaar complex te vormen dat veel beter hecht aan de dikke peptidoglycaanlaag die wordt aangetroffen in Gram-positieve bacteriecellen dan alleen het kristalviolet alleen. Er is geen wasstap met water na het toevoegen van het jodium.

Verkleiner-alcohol

Ofwel aceton of ethylalcohol kan worden gebruikt als het ontkleurende middel. De alcohol lost lipiden op die zich in het buitenste celmembraan van gramnegatieve bacteriën bevinden, waardoor het kristal-violet-jodiumcomplex uit de dunnere peptidoglycaanlaag kan lekken. De alcohol wordt gedurende 10 tot 20 seconden toegevoegd; het wordt op de glijbaan gegoten totdat al het jodium is weggewassen en de afvloeiing kleurloos is. Op dit punt in het Gram-kleuringsproces zijn Gram-negatieve bacteriën kleurloos, terwijl Gram-positieve bacteriën nog steeds het kristalviolet vasthouden. Na afloop moet de dia worden afgespoeld met water om het ontkleurende effect te stoppen.

Tegenkleuring-Safranine

Safranin wordt vervolgens toegevoegd om de zichtbaarheid en het contrast met de kleurloze Gram-negatieve bacteriën te vergroten. De vlek zorgt ervoor dat deze bacteriën roze lijken onder de microscoop. Omdat de vlek aan het hele monster wordt toegevoegd, worden er ook grampositieve bacteriën opgezuiverd, maar het donkerdere van het kristalviolet verbergt de lichtere safraninroze kleur. Nadat het dia-monster ongeveer een minuut lang met safranin is overstroomd, wordt water gebruikt om overtollige vlekken die niet hechtten aan de bacteriecellen af ​​te wassen.