Onderzoekers hebben een efficiënter platform ontwikkeld voor het bestuderen van eiwitten die een sleutelrol spelen bij het reguleren van genexpressie. De aanpak maakt gebruik van gemanipuleerde gistcellen om enzym- en histon-eiwitten te produceren, intern biochemische testen uitvoeren, en laat vervolgens de resultaten zien.

"Biomedische en biotech-onderzoekers zijn geïnteresseerd in de mechanismen die histonen in staat stellen om genactiviteit te reguleren, " zegt Alison Waldman, eerste auteur van een paper over het werk en een Ph.D. student aan de North Carolina State University. "Maar de conventionele hulpmiddelen voor histononderzoek zijn onpraktisch en traag. We wilden iets sneller en goedkoper ontwikkelen - en dat hebben we gedaan."

Bij complexe organismen chromosomen bestaan ​​grotendeels uit DNA en een groep eiwitten die histonen worden genoemd. Deze histonen zijn belangrijk voor het goed inpakken van het DNA in chromosomen, maar spelen ook een rol bij het reguleren van genexpressie. Met andere woorden, ze helpen bepalen wanneer en hoe specifieke genen worden in- of uitgeschakeld.

Een van de kenmerken die histonen moeilijk maakt om te bestuderen, is dat ze vaak chemische modificaties hebben die, alleen of in combinatie, de rol die de histon speelt bij genexpressie veranderen.

"Histonen dienen in wezen als aanlegplaatsen voor andere eiwitten die genexpressie beïnvloeden, en de chemische modificaties die we op histonen zien, spelen een rol bij het bepalen welke eiwitten toegang hebben tot een bepaald gen, " zegt Balaji Rao, co-corresponderende auteur van het papier en een professor in chemische en biomoleculaire engineering aan NC State.

En om het nog ingewikkelder te maken, dit is een dynamisch proces. Een histon mag geen wijzigingen hebben, het kan een wijziging behouden gedurende de hele levensduur van de cel, of wijzigingen kunnen herhaaldelijk worden toegevoegd en verwijderd. Er is, Kortom, veel gebeurt. En enzymen zijn de katalysatoren die verantwoordelijk zijn voor al die veranderingen. In principe, enzymen zijn het mechanisme voor het bevestigen of verwijderen van histonmodificaties.

Dus als je echt wilt begrijpen wat er met histonen aan de hand is, je moet de chemische modificaties begrijpen. Maar als je de chemische modificaties wilt begrijpen, je moet begrijpen welke enzymen aanwezig zijn en wat ze doen.

Conventionele methoden om te begrijpen hoe enzymen een histon wijzigen, omvatten het gebruik van een van de twee technieken. Eerst, je zou chemische synthese kunnen gebruiken om enzymen en histon-eiwitten te maken, voer vervolgens een test uit in een reageerbuis om te zien wat er gebeurt. Tweede, je zou één bacterie genetisch kunnen manipuleren om een ​​enzym te produceren en andere bacteriën om histon-eiwitten te produceren, oogst vervolgens de relevante eiwitten, zuiver ze, voer vervolgens een test uit om te zien wat er gebeurt.

"Onze techniek gebruikt een genetisch gemodificeerde gistcel om zowel het enzym als de histon te produceren, " zegt Waldman. "De chemische modificatie vindt plaats in de cel, en de resulterende gewijzigde histon wordt verzonden naar en weergegeven op het oppervlak van de cel."

"Met andere woorden, de gistcel maakt de relevante eiwitten, doet de test voor u, en geeft vervolgens het resultaat bovenaan weer, " zegt Albert Keung, co-corresponderende auteur van het werk en een assistent-professor chemische en biomoleculaire engineering bij NC State.

Het gemodificeerde gistplatform is aanzienlijk sneller dan conventionele technieken. Bijvoorbeeld, het onderzoeken van een enkele enzym / histon-koppeling zou een paar dagen duren, in plaats van een week.

"Maar het is makkelijker op te schalen dan bestaande technieken, dus je zou aanzienlijk meer tijd besparen als je naar veel eiwitten zou kijken, ' zegt Keung.

"In aanvulling, er zijn sommige eiwitten die niet kunnen worden gemaakt met behulp van chemische synthese, of dat niet kan worden gezuiverd, " zegt Rao. "Onze techniek vereist geen chemische synthese of zuivering, wat betekent dat we kunnen kijken naar eiwitten die in het verleden moeilijk of onmogelijk te testen waren."

De onderzoekers toonden het nut van de techniek aan door gemanipuleerde gistcellen twee soorten histonen te laten produceren en een goed bestudeerd enzym genaamd p300, die een specifieke acetylgroepmodificatie aan histonen toevoegt.

"We hebben laten zien dat onze techniek werkt, " Zegt Waldman. "De volgende stap is om te beginnen met het uitbreiden van de wijzigingen die we bekijken en het opschalen van het proces."

De krant, "De residuspecificaties van epigenome-enzymen in kaart brengen door middel van gistoppervlakteweergave, " is gepubliceerd in het tijdschrift Cel Chemische Biologie .