Site-directed spin labeling (SDSL) gebruikt in combinatie met elektronen paramagnetische resonantie (EPR) spectroscopie is een beproefde en vertrouwde techniek voor het ophelderen van de structuur, functie en dynamiek van eiwitten en eiwitcomplexen. Op nitroxide gebaseerde spinlabels behoren tot de meest populaire en best gevestigde labels omdat ze klein zijn, niet storend en vertonen uitstekende spectroscopische eigenschappen. "Ideale procedures voor spin-labeling vertonen hoge reactiesnelheden en selectiviteit, " legt professor Malte Drescher uit, Professor voor spectroscopie van complexe systemen aan de afdeling scheikunde van de Universiteit van Konstanz en hoofdauteur van de studie samen met professor Valentin Wittmann, die gespecialiseerd is in organische synthese.

"Het kan een probleem zijn om tegelijkertijd een hoge reactiviteit en hoge selectiviteit te bereiken, " vervolgt Drescher. "Conventionele spinlabels gebaseerd, bijvoorbeeld, op Gadolinium(III) of trityl, vertonen ofwel zeer brede spectra en lage modulatiediepten ofwel zeer smalle spectra die ongeschikt zijn voor het soort experimenten dat we willen uitvoeren." Een nieuwe studie gepubliceerd door Drescher, Wittmann en hun team van scheikundigen van de Universiteit van Konstanz, die online in het tijdschrift werd gepubliceerd ChemBioChem Communicatie op 14 augustus 2019, introduceert een nieuwe benadering voor het labelen van eiwitten met op nitroxide gebaseerde spinlabels en genetisch gecodeerde niet-canonieke aminozuren (ncAA's) als doelen voor SDSL.

"Nitroxiden bieden een ideale spectrale breedte en toegang tot dynamische informatie, " zegt Anandi Kugele, een doctoraal onderzoeker aan de Konstanz Research School of Chemical Biology (KoRS-CB) en eerste auteur van de studie, die een prestigieuze reisbeurs ontving van het National High Magnetic Field Laboratory om de resultaten te presenteren op de 2019 Rocky Mountain Conference on Magnetic Resonance in Denver, Colorado (VS). "Traditionele op nitroxide gebaseerde labels hebben een beperkte redoxstabiliteit, wat een nadeel is voor in-cell toepassingen. De uitdaging voor ons was om de stabiliteit van nitroxide te vergroten en zo op nitroxide gebaseerde spinlabels aan te passen voor toekomstig routinematig in vivo gebruik." de onderzoekers ontwikkelden een nieuw spin-label dat aan eiwitten kan worden gehecht door middel van inverse-electron-demand Diels-Alder (DAinv) cycloadditie aan genetisch gecodeerde ncAA's, een methode die geschikt is gebleken voor een breed scala aan in vitro en in vivo toepassingen. Om nitroxidestabiliteit te bereiken, de onderzoekers gebruikten verder een beschermingsstrategie op basis van fotoverwijderbare beschermende groepen, waarvan bekend is dat ze nitroxiden beschermen en indien nodig afgeven.

Het nieuwe spin-label, genaamd fotoactiveerbaar nitroxide voor DAinv-reactie, of kortweg PaNDA - is oplosbaar in water, EPR-actief en deprotection-efficiënt als zowel in vitro als in lysaattests met de twee modeleiwitten green fluorescent protein (GFP) en Escherichia coli oxidoreductase thioredoxine (TRX), die in vrijwel alle bekende organismen wordt aangetroffen, voorstellen. "We moeten de methode verbeteren die wordt gebruikt om het PaNDA-spinlabel aan cellen te leveren en om de efficiëntie van labeling en ontscherming in de cel te testen, onder andere, " concludeert Malte Drescher:"Maar ons onderzoek toont duidelijk aan dat, in principe, het PaNDA-label kan worden gebruikt voor EPR-metingen in uitdagende biologische omgevingen, inclusief de binnenkant van cellen. Onze tests met E. coli-lysaat zijn in dit opzicht veelbelovend. Dit zal een heel nieuw scala aan mogelijkheden openen voor de studie van eiwitten door middel van EPR-spectroscopie."