In een recente studie uitgevoerd door Hongri Gong en collega's, een respiratoir supercomplex werd geïsoleerd uit de bacterie Mycobacterium smegmatis, en de structuur ervan werd gevisualiseerd met een resolutie van 3,5 A met behulp van cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM). De bacterie is nauw verwant aan M. tuberculosis en een populair model dat wordt gebruikt om veel andere bacteriesoorten te bestuderen. De gedetailleerde structuur onthulde hoe elektronen in de cel werden overgebracht in een tot nu toe ongezien proces.

Typisch, chemische energie om adenosinetrifosfaat (ATP) te synthetiseren en cellulaire krachtreacties wordt geëxtraheerd tijdens cellulaire ademhaling door de oxidatie van een energiebron (suikers, vetzuren en aminozuren) en de reductie van een elektronenacceptor (zuurstof, zwavel, nitraat en sulfaat). Bij aerobe cellulaire ademhaling, energie wordt geëxtraheerd van elektronendonoren naar de terminale acceptor, zuurstof, via de elektronentransportketen (ETC) om een ​​transmembraan-protongradiënt te creëren die bekend staat als een proton-aandrijfkracht (PMF) die de ATP-synthese aandrijft. De nieuwe resultaten zijn nu gepubliceerd in Wetenschap onthullen een directe link voor elektronenoverdracht tussen enzymen om een ​​nieuwe manier van katalyse van de ademhalingsketen te vertegenwoordigen.

Chinonen en cytochromen zijn twee soorten elektronendragers in ETC's die worden gebruikt om elektronen van en naar grote macromoleculaire structuren die in het membraan zijn ingebed, te pendelen. Vier membraanoxidoreductasen zijn betrokken bij de mitochondriale ademhalingsketen voor elektronenoverdracht. Deze omvatten complex I (NADH:ubiquinonoxidoreductase, CI), complex II (succinaat:ubiquinonoxidoreductase, CII), complex III (bc ₁ -type ubiquinol:cytochroom-c-oxidoreductase, bc ₁ -type CIII) en complex IV (aa ₃ -type cytochroom c-oxidase, aa ₃ -type CIV). per functie, CIII kan ubiquinol oxideren tot ubiquinon en de elektronen doorgeven aan oplosbaar cytochroom c. Elektronen worden vervolgens naar CIV getransporteerd, waar zuurstof wordt gereduceerd tot water. Het transmembraan PMF wordt gegenereerd door protonpompen in CI, CIII en CIV.

In de prokaryotische ademhalingsketen, de situatie is ingewikkelder. Een volledige route van elektronenstroom is nog niet bepaald in het celtype vanwege de complexiteit ervan. Het is daarom noodzakelijk om de volledige structuur van een "supercomplex" dat betrokken is bij bacteriële elektronenoverdracht te begrijpen om het doel te helpen. In de studie, de onderzoekers hebben het complex uit M. smegmatis geëxtraheerd en gezuiverd om de architectuur te visualiseren met behulp van cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) met een resolutie van 3,5 . De structuur verschafte cruciale inzichten in het mechanisme van directe elektronenoverdracht binnen een respiratoir supercomplex. De afmetingen van het supercomplex lagen in het bereik van 200 x 70 x 120 , in een symmetrische lineaire architectuur die totaal verschilt van eerder gerapporteerde respiratoire supercomplexen. door samenstelling, de lineaire dimeer CIV ₁ -CIII ₂ -CIV ₁ was zo gerangschikt dat individuele CIV's aan weerszijden het centrale CIII-dimeer flankeerden. De informatie onthulde een direct verband tussen enzymen tijdens elektronenoverdracht, die een nieuwe manier van katalyse van de ademhalingsketen vertegenwoordigen. De gedetailleerde structurele bevindingen kunnen helpen bij het ontdekken van antimycobacteriële geneesmiddelen.

Tijdens bacteriële celcultuurexperimenten, de auteurs gebruikten een M. tuberculosis-achtige waterstofperoxide-resistente M. smegmatis mutante stam. De cellen werden gekweekt en het membraan werd geïsoleerd zoals eerder beschreven. Na celkweek, oogsten en cellysis, celmembraanpellets werden geoogst om respiratoire supercomplexen te extraheren. De supercomplexen werden gekarakteriseerd met behulp van optische spectroscopie, massaspectroscopie en 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) kleuring. Om heemgroepen te identificeren, geselecteerde fracties werden geanalyseerd door spectra op te nemen voor en na reductie met dithionaat zoals eerder beschreven. De gezuiverde monsters werden geanalyseerd met behulp van natieve massaspectroscopie om de architectuur te onderzoeken en de individuele structurele componenten werden geanalyseerd met behulp van eerder vastgestelde protocollen.

Tijdens cryo-EM-analyse, de onderzoekers gebruikten uranylacetaat (1 procent w/v) voor negatieve kleuring, met behulp van 5 µl van het supercomplex monster in een concentratie van 0,05 mg/ml, afbeeldingen werden genomen op een FEI Tecnai Spirit-microscoop die werkte bij 120 kV voor de eerste modelbouw. De verkregen beelden werden verwerkt met behulp van een reconstructie met lage resolutie van het supercomplex van 53 microfoto's van het negatief gekleurde monster. Voor een volledige reconstructie van het supercomplex, de auteurs selecteerden handmatig 7, 600 microfoto's van 8, 200 originele microfoto's tijdens cryo-EM-beeldverwerking. Alle figuren in het onderzoek zijn gemaakt met behulp van PyMOL- of UCSF-chimaera.

De auteurs onthulden de cryo-EM-structuur van een CIII-CIV respiratoir supercomplex van de M. smegmatis-bacterie. De intra-complexe elektronenoverdrachtroute varieerde van quinoloxidatie in CIII tot zuurstofreductie in CIV. De resultaten toonden een nieuw mechanisme voor het splitsen van elektronenoverdracht om de voltooiing van de Q-cyclus (de netto beweging van protonen over een lipidedubbellaag) voor energietransductie te verzekeren. De associatie van een superoxide-dismutase in de architectuur van het systeem kan beschermen tegen oxidatieve schade door reactieve zuurstofsoorten (ROS). De architectuur van chinonbindingsplaatsen bood ook een kader voor toekomstige studies in op structuur gebaseerde antimicrobiële geneesmiddelenontdekking.

© 2018 Wetenschap X Netwerk