Wetenschappers hebben het mechanisme geïdentificeerd waarmee fluorescerende eiwitten in twee fasen van kleur kunnen veranderen. Daarmee leggen ze de basis voor nieuwe toepassingen in microscopie en functionele analyses in biologisch onderzoek.

Het begon allemaal met een observatie die ETH-wetenschappers ongeveer twee jaar geleden maakten met een speciaal fluorescerend eiwit geïsoleerd uit koralen, Dendra 2, die groen fluoresceert. Licht kan worden gebruikt om de moleculaire structuur te veranderen, zodat het van kleur verandert in rood. De onderzoekers ontdekten een nieuwe manier om deze kleurverandering teweeg te brengen:het wordt kort aangeslagen met een puls van blauw laserlicht en vervolgens onmiddellijk verlicht met nabij-infrarood licht. Toepassingen voor deze tweefasige kleurschakelaar zijn onder meer fluorescentiemicroscopie.

Een internationaal team van onderzoekers onder leiding van Periklis Pantazis, van de afdeling Biosystems Science and Engineering (D-BSSE) aan de ETH Zürich in Basel, heeft nu dit tweefasige kleurschakelmechanisme uitgelegd. De wetenschappers noemen dit 'primed conversie'. Met de nieuwe kennis kunnen de onderzoekers andere lichtgevoelige eiwitten aanpassen, zodat ze ook in twee fasen kunnen worden geëxciteerd.

De onderzoekers van ETH Zürich, het Karlsruhe Instituut voor Technologie, en de Janelia Research Campus in Ashburn, Virginia, onderzocht nauwkeurig de met blauw licht geactiveerde eiwitten en slaagde erin aan te tonen dat deze eiwitten in een aangeslagen toestand komen die enkele milliseconden aanhoudt. "Dat is relatief lang, " legt Pantazis uit. "Andere fluorescentieverschijnselen zijn veel korter."

De wetenschappers toonden ook aan dat deze toestand een geval is van een fenomeen dat bekend is uit de kwantumchemie - een 'triplettoestand'. Na ongeveer vijf milliseconden, het fluorescerende eiwit Dendra 2 keert terug naar zijn grondtoestand. Primed-conversie vindt alleen plaats als de tweede fase - verlichting met nabij-infrarood licht - plaatsvindt binnen het triplet-tijdvenster.

Gewijzigde aminozuursequenties

De duur van de triplettoestand hangt sterk af van de stabiliteit van het fluorescerende eiwit. Dit, beurtelings, hangt af van de exacte volgorde van eiwitbouwstenen (aminozuren), daarom hebben de wetenschappers de Dendra 2-aminozuursequentie op verschillende plaatsen gewijzigd. Vervolgens, ze deden hetzelfde met een ander fluorescerend eiwit, Eos. Tot nu, dit eiwit kon niet in twee fasen worden aangeslagen. Het is gedocumenteerd in de wetenschappelijke literatuur dat deze locaties essentieel zijn voor de triplet-toestand.

De wetenschappers maten de duur van de triplet-toestand met alle nieuwe eiwitten. Deze toestand was significant verlengd in verschillende van de geteste eiwitten. De wetenschappers waren ook in staat om het Eos-eiwit te modificeren, zodat het ook in twee fasen kon worden geactiveerd. Dat lukte met nog eens zes eiwitten die nog nooit eerder in twee fasen waren geactiveerd. “De gemodificeerde eiwitten zijn niet alleen voor het eerst in twee fasen schakelbaar gemaakt, ze zijn ook stabieler en fluoresceren daardoor intenser, " zegt Manuel Mohr, een doctoraatsstudent in de groep van Pantazis en hoofdauteur van de studie.

De wetenschappers deden de oorspronkelijke ontdekking met een laser die niet conventioneel beschikbaar is, die gebruik maakt van licht in het nabij-infraroodbereik. Vandaag, echter, de wetenschappers hebben aangetoond dat het effect ook kan worden bereikt met dezelfde conventionele rode lasers die in elke fluorescentiemicroscoop worden gebruikt. Met andere woorden, geprimed conversie is mogelijk met elke fluorescentiemicroscoop.

Primed-conversie kan in microscopie worden gebruikt om een ​​nauw gedefinieerd punt in een weefselmonster te markeren. De wetenschappers doen dit door een blauwe en rode laserstraal in het weefsel te richten, zodat de stralen elkaar op één punt kruisen. Primed conversie vindt alleen plaats op dit kruispunt. "Omdat noch blauw noch rood laserlicht een toxisch effect heeft, de methode is ideaal voor levende organismen, ", zegt Pantazis. Toepassingen met andere microscopietechnieken zijn misschien ook mogelijk, inclusief superresolutiemicroscopie, die al een aantal jaren bestaat.

Hersenkartering en gensequencing

"We weten nu hoe we fotoconverteerbare eiwitten kunnen aanpassen om ze in twee fasen te laten overschakelen, " says Pantazis. The ETH scientists are working together with protein experts to modify other fluorescent proteins used in microscopy in the same way.

The researchers recently modified proteins so that they can be split off from a gene-activating messenger in a way that allows them to be light-activated with two colours. Bijvoorbeeld, they could illuminate tissue with a blue and red beam intersecting at a single point, making it possible to activate specific genes in a single cell of the tissue. Proteins that detect calcium can be modified in this way, ook, and could potentially be used for 3-D brain mapping.

Biologists can ultimately use the new technique for other functional analyses in 3-D. ETH Zurich has already issued several licences for the patent, including to a start-up that plans to develop a DNA sequencing technique using a 3-D matrix.