Onderzoekers van de Lomonosov Moscow State University hebben in samenwerking met Deense moleculaire fysici het mechanisme onthuld dat de gevoeligheid van groen fluorescerend eiwit voor blootstelling aan licht bepaalt. De wetenschappers hebben bewezen dat een geïsoleerde chromofoorgroep in staat is om licht uit te zenden buiten de eiwitomgeving, terwijl de eiwitfunctie is om de fluorescerende eigenschappen ervan te verbeteren. De resultaten worden gepubliceerd in de Tijdschrift van de American Chemical Society .

Eiwitten uit de GFP-familie worden veel gebruikt als biomarkers. Met hun hulp, onderzoekers konden biologische processen visualiseren die plaatsvinden in levende cellen. Deze eiwitten worden veel gebruikt in de moleculaire en cellulaire biologie vanwege hun unieke vermogen om te fluoresceren bij absorptie van licht van een bepaalde golflengte.

Chromofoor groepen, of chromoforen, zijn verantwoordelijk voor lichtabsorptie. De chromofoor is samengesteld uit slechts drie aminozuurresten. Tot nu, onderzoekers geloofden dat de eiwitomgeving ervoor zorgde dat de chromofoor licht uitstraalde onder bestraling. Dit idee werd ondersteund door het feit dat de geïsoleerde chromofoor zijn fluorescerende eigenschappen verliest bij eiwitdenaturatie, d.w.z. ontvouwen van het eiwit. Voor de eerste keer, de auteurs hebben voorspeld en experimenteel bewezen dat de geïsoleerde chromofoor ook buiten de eiwitomgeving kan fluoresceren, maar alleen bij bepaalde temperaturen.

Na absorptie van licht, het fluorescerende eiwit krijgt extra energie en ondergaat een overgang naar de elektronisch aangeslagen toestand. Het eiwitmolecuul streeft ernaar om terug te keren naar de grondtoestand door de overtollige energie kwijt te raken. Dit proces wordt deactivering genoemd en verloopt op twee manieren. De eerste is fluorescentie. Tijdens de overgang van de aangeslagen toestand naar de grondtoestand, de chromofoor straalt energie uit in de vorm van licht, en als een resultaat, het eiwit wordt lichtgevend.

De tweede manier wordt non-radiative relaxatie genoemd. Tijdens dit proces, elektronische opwindingsenergie, overgebracht naar een molecuul bij lichtabsorptie, wordt omgezet in trillingsenergie van kernen. Interne omzetting in het groen fluorescerende eiwit wordt gevolgd door een chemische reactie - cis-trans-isomerisatie van de chromofoor (d.w.z. intramoleculaire rotatie rond een van de dubbele bindingen in het molecuul).

In het geval van de anionische (negatief geladen) chromofoor van het groen fluorescerende eiwit, energie kan ook worden overgedragen aan één elektron, die de chromofoor verlaat. de chromofoor, die isomerisatie ondergaat of een elektron verliest, verwijdert overtollige elektronische energie en fluoresceert niet. Fluorescentie wordt een stralingskanaal van deactivering genoemd, terwijl interne conversie en elektronenemissie niet-stralingskanalen worden genoemd. De wetenschappers hebben beide niet-stralingskanalen experimenteel gebruikt om het verval in de aangeslagen toestand en het herstel in de grondtoestand van de geïsoleerde GFP-chromofoor bij verschillende temperaturen te bestuderen.

De wetenschappers hebben aangetoond dat de geïsoleerde GFP-chromofoor in de aangeslagen toestand kan worden opgesloten vanwege de aanwezigheid van intrinsieke energiebarrières langs de niet-stralingsdeactiveringsroutes. Wanneer de chromofoor wordt afgekoeld tot 100 K, de vangst duurt nanoseconden, waardoor het langzame stralingskanaal mogelijk wordt. De vangbarrières voorkomen dat de chromofoor terugkeert naar de grondtoestand door snelle niet-stralingsconversie en ervoor zorgen dat het molecuul fluoresceert.

Chemicus Anastasia Bochenkova van de Lomonosov Moscow State University zegt:"De GFP-chromofoor is intrinsiek fluorescerend. Interacties tussen de chromofoorgroep en de dichtstbijzijnde eiwitomgeving verbeteren de omstandigheden voor het vangen van de chromofoor in de aangeslagen toestand, waardoor de moleculaire fluorescentie wordt verbeterd. Als resultaat, het stralingskanaal wordt al bij kamertemperatuur overheersend in het eiwit."

De wetenschappers hebben de chromofooreigenschappen zowel theoretisch als experimenteel bestudeerd. De wetenschappers werkten een theoretisch model uit en schatten de levensduur in aangeslagen toestand van de geïsoleerde chromofoor, gebaseerd op de hoogwaardige kwantumchemieberekeningen. Dergelijke berekeningen vereisen krachtige computerbronnen, en de wetenschappers gebruikten het Lomonosov Supercomputing Center voor hun studies.

De Deense wetenschappers ontwierpen en creëerden een nieuwe experimentele techniek voor het bestuderen van door licht geïnduceerde moleculaire dynamica van geïsoleerde geladen chromoforen in vacuo-femtoseconde pomp-sonde actiespectroscopie met 2D temporele resolutie. Zowel de vertragingstijd tussen twee femtoseconde laserpulsen als de vervaltijd van een bepaalde moleculaire actie werden gevarieerd. De nieuwe techniek lost de door licht geïnduceerde dynamiek van de GFP-chromofoor op zoals deze plaatsvindt in verschillende vervalkanalen door zowel de geëxciteerde als de geaarde elektronische toestanden, afhankelijk van de temperatuur. Op basis van de resultaten, de onderzoekers hebben geconcludeerd dat inheemse GFP-chromoforen intrinsiek in staat zijn om buiten de eiwitomgeving te fluoresceren met een levensduur van nanoseconden, theoretische voorspellingen volledig ondersteunen.

Anastasia Bochenkova zegt, "Ons onderzoek is gericht op het onthullen van moleculaire mechanismen van het functioneren van levende systemen. Een fundamentele uitdaging is om de relatie tussen de eigenschappen van een heel lichtgevoelig biosysteem en zijn veel kleinere actieve chromofoor te begrijpen, die de kern vormt van de moleculaire machinerie. Hier, we hebben aangetoond dat de eigenschappen van een enkele chromofoor belangrijk zijn voor het begrijpen van de werkingsmechanismen van het gehele GFP-eiwit. Deze kennis bevindt zich op het snijvlak van natuurkunde, scheikunde en biologie, en resulteert in het herzien van het heersende paradigma over de rol van de eiwitomgeving in de fluorescentie van het GFP-eiwit. Naast het oplossen van de vraag over de oorsprong van de intrinsieke fluorescentie van GFP, het werk laat zien dat gedetailleerde moleculaire kennis die is verkregen door kwantumchemieberekeningen op hoog niveau, samen met moleculaire engineering kan worden gebruikt bij het ontwerpen van nieuwe functionele biomaterialen met optimale fotorespons."