Door Palmer Owyoung · Bijgewerkt 24 maart 2022

Bacteriën worden gekweekt op agar in petrischalen en vormen zichtbare kolonies die groepen cellen vertegenwoordigen. Hoewel een eenvoudige kolonietelling een snelle schatting van de bacteriële belasting kan opleveren, leveren kwantitatieve methoden zoals het aantal levensvatbare kiemplaten zowel absolute cijfers als kwalitatieve inzichten op in hoe verschillende omstandigheden de groei beïnvloeden. Omdat een enkel schaaltje miljarden cellen kan bevatten, moet de cultuur eerst serieel worden verdund tot een niveau waarop individuele kolonies betrouwbaar kunnen worden geteld.

Stap 1 – Seriële verdunning

Begin in een steriel buisje van 1,5 ml. Pipetteer 10 µl van de startcultuur in 90 µl steriel verdunningsmedium (bijvoorbeeld een fosfaatgebufferde zoutoplossing). Sluit de buis af, vortex zachtjes en je hebt een verdunning van 10⁻¹. Herhaal de overdracht van 10 µl naar vers medium van 90 µl om een ​​verdunning van 10⁻² te genereren, enzovoort. Ga door totdat je een verdunning tussen 10⁻⁴ en 10⁻¹⁰ bereikt. Label elke buis (10‑1, 10‑2, …) om de verdunningsfactor bij te houden.

Stap 2 – Plateren

Neem 10 µl uit de meest verdunde buis die nog steeds telbare kolonies oplevert (doorgaans 30–300 per plaat). Verdeel het inoculum gelijkmatig over het agaroppervlak met een glazen spreider, draai de plaat 90° en herhaal. Bereid ten minste drie platen per verdunning voor om statistische betrouwbaarheid te garanderen. Laat de strooier een paar minuten drogen op een vuur of op een bank, plaats dan de deksels terug en incubeer bij de optimale temperatuur voor het organisme (meestal 35–37°C) gedurende 12–16 uur.

Stap 3 – Kolonietelling

Inspecteer na de incubatie elke plaat op een telbaar aantal kolonies. Markeer de bodem van de schaal (niet het deksel) met een permanente marker op de positie van elke kolonie en tel de stippen. Kies platen die tussen de 30 en 300 kolonies bevatten voor nauwkeurige statistieken.

Stap 4 – CFU-berekening

Bereken de kolonievormende eenheden (CFU) per milliliter van de oorspronkelijke cultuur met behulp van de formule:

CFU/ml = (aantal kolonies) × 10×10ⁿ

waarbij n de negatieve exponent is van de verdunningsfactor (bijvoorbeeld voor een verdunning van 10⁻⁷, n =7). De factor 10 is verantwoordelijk voor het inoculumvolume van 10 µl.

Dingen die nodig zijn

• Seriële verdunningsmedia (bijv. PBS of tryptische sojabouillon)
• Pipetten en steriele tips
• Microcentrifugebuisjes
• Agarplaten met geschikt groeimedium
• Vortexmixer
• Bunsenbrander
• Glazenstrooiers
• 70% ethanol

TL;DR

Steriliseer de spreader in 70% ethanol, steek hem aan met de vlam van een bunsenbrander, laat de alcohol wegbranden en koel hem af op het droge agaroppervlak. Hierdoor worden eventuele resterende microben gedood vóór het uitplaten.

Veiligheidsmededeling

Behandel alle bacterieculturen als potentieel gevaarlijk. Volg de institutionele richtlijnen voor bioveiligheid en gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.