yacobchuk/iStock/GettyImages

Overzicht

Dubbelstrengs DNA is de genetische blauwdruk in elke levende cel, maar de procedures voor het isoleren van genomisch DNA van hoge kwaliteit variëren aanzienlijk tussen dierlijke en plantaardige weefsels.

Algemene extractieworkflow

Cellyse begint met een detergens die lipidemembranen verstoort, waardoor chromatine vrijkomt uit kern- en organelmembranen. Het mengsel wordt vervolgens behandeld met alcohol om DNA te precipiteren. Hoewel de basisstappen worden gedeeld, zijn de efficiëntie en zuiverheid van het eindproduct afhankelijk van de specifieke cellulaire architectuur en de aanwezigheid van verontreinigingen.

Verschillende celstructuren

Plantencellen hebben een stijve celwand die bestaat uit cellulose, hemicellulose en pectine, en bevatten chloroplasten die een reeks secundaire metabolieten genereren. Veel plantengenomen zijn polyploïde, waardoor zowel de hoeveelheid DNA als de complexiteit toenemen. Dierlijke cellen hebben geen celwand en zijn afhankelijk van detergentia zoals natriumdodecylsulfaat (SDS) om het plasmamembraan te doorbreken.

Uitdagingen voor DNA-extractie bij planten

Het doorbreken van de plantencelwand is de eerste hindernis. Mechanische homogenisatie of enzymatische vertering met cellulase en pectinase verwijdert de barrière. Polysachariden, fenolverbindingen en tannines kunnen echter samen met DNA neerslaan, waardoor de zuiverheid afneemt. Zorgvuldige wasstappen en het gebruik van buffers met een hoog zoutgehalte helpen deze onzuiverheden te verminderen.

Overwegingen bij de extractie van dierlijk DNA

Perifere bloedleukocyten zijn de meest voorkomende bron van dierlijk genomisch DNA. Bloed bevat eiwitten, lipiden en celresten die samen met DNA kunnen worden geëxtraheerd. De belangrijkste verontreiniging is heem, het niet-eiwitgedeelte van hemoglobine, dat de stroomafwaartse enzymatische reacties verstoort. Het gebruik van een lysisbuffer voor rode bloedcellen, gevolgd door een zuiveringskolom of extractie met fenol-chloroform, verwijdert heem en verbetert de opbrengst.

Vergelijkende DNA-eigenschappen

Plantengenomen zijn vaak groter en complexer dan dierlijke genomen, deels als gevolg van genduplicatie en repetitieve elementen. Dit grootteverschil heeft invloed op de benodigde hoeveelheid uitgangsmateriaal en de capaciteit van extractiebuffers. Bovendien kan de aanwezigheid van secundaire metabolieten in planten de samenstelling van basenparen veranderen, waardoor de PCR-amplificatie en de kwaliteit van de sequentiebepaling worden beïnvloed.

Praktische tips voor zeer zuiver DNA

• Gebruik RNase om RNA-besmetting te elimineren.
• Voeg een proteasestap toe om resterende eiwitten af te breken.
• Pas een kolom op basis van silica of een zuivering met magnetische kralen toe voor consistente resultaten.
• Kwantificeer DNA met een fluorometrische test om overschatting door spectrofotometrie te voorkomen.

Door het extractieprotocol af te stemmen op het specifieke celtype kunnen onderzoekers betrouwbaar, zeer zuiver genomisch DNA verkrijgen dat geschikt is voor verdere toepassingen zoals sequencing, PCR en klonen.