Comstock/Comstock/Getty Images

Voordat DNA kan worden gesequenced of bewerkt, moeten onderzoekers het eerst isoleren uit de cellulaire matrix. Hoewel cellen een mix van eiwitten, lipiden, koolhydraten en kleine moleculen bevatten, maken de unieke chemische eigenschappen van DNA het mogelijk om het te scheiden en te zuiveren voor verdere analyse.

Cellyse

De eerste stap in elke DNA-extractieworkflow is cellyse. Afhankelijk van het monstertype en de vereiste zuiverheid kiezen laboratoria uit mechanische, enzymatische of op detergentia gebaseerde methoden. Detergenten maken celmembranen oplosbaar, hoogfrequente ultrasone golven (sonicatie) verstoren membranen door cavitatie, en het kloppen van kralen (waarbij glaskralen tegen het monster trillen) zorgt voor een snelle, fysieke verstoring waardoor nucleïnezuren vrijkomen.

Snelle en smerige aanpak

Wanneer snelheid zwaarder weegt dan zuiverheid, passen wetenschappers soms een minimale opruiming toe. Door proteïnaseK toe te voegen, wordt het merendeel van de eiwitten afgebroken, waardoor het monster met slechts milde zuivering kan worden gebruikt. Als alternatief kunnen hoge zoutconcentraties (bijvoorbeeld ammonium- of kaliumacetaat) eiwitten neerslaan, maar er blijven veel andere verontreinigingen achter. Deze methoden zijn geschikt voor snelle screening, maar ongeschikt voor toepassingen waarbij DNA van hoge kwaliteit vereist is.

Fenol-Chloroform-extractie

Fenol-chloroformextractie blijft een klassieke techniek, hoewel deze nu minder gebruikelijk is vanwege de toxiciteit en de arbeidsintensiteit. Cellen worden gelyseerd met detergens en vervolgens gemengd met een mengsel van fenol:chloroform:isoamylalcohol. Na centrifugatie wordt de oplossing gescheiden in een waterfase (onder) die DNA vasthoudt en een organische fase (boven) die eiwitten en lipiden opvangt. Zorgvuldige controle van de zoutconcentratie en pH is essentieel voor een optimaal herstel. Omdat fenol en chloroform gevaarlijk zijn, zijn veel laboratoria overgestapt op veiligere alternatieven.

Anionenuitwisselingschromatografie

Anionenuitwisselingschromatografie biedt een hogere zuiverheid en reproduceerbaarheid. De kolommatrix bevat positief geladen groepen die negatief geladen DNA binden. Eiwitten, RNA en andere verontreinigingen worden weggespoeld en DNA wordt vervolgens geëlueerd met een zoutrijke buffer. Deze methode is vooral waardevol voor zuivering op preparatieve schaal.

Commerciële kits

Op silica gebaseerde spinkolomkits zijn de gouden standaard geworden voor snelle, reproduceerbare DNA-zuivering. DNA bindt zich aan een silicamembraan in de aanwezigheid van chaotrope zouten, terwijl verontreinigingen worden weggespoeld. Na een laatste zoutarme spoeling wordt het DNA geëlueerd in een kleine hoeveelheid TE of water, waardoor binnen enkele minuten materiaal van hoge kwaliteit ontstaat.

Zuiverheid beoordelen aan de hand van absorptie

Na isolatie wordt de DNA-oplossing doorgaans in een pH-gecontroleerde buffer geplaatst. De zuiverheid ervan wordt geverifieerd door de ultraviolette absorptie bij 260 nm en 280 nm te meten. Een verhouding van 260/280 van ~1,8 duidt op een hoge zuiverheid, terwijl lagere verhoudingen wijzen op eiwitverontreiniging. Absorptie bij 260 nm geeft ook een eenvoudige schatting van de DNA-concentratie.