1. Het isoleren van het menselijke insuline -gen

* mRNA -extractie: Menselijke insuline mRNA wordt geëxtraheerd uit cellen die insuline produceren (bètacellen in de alvleesklier).

* reverse transcriptie: Het mRNA wordt omgezet in complementair DNA (cDNA) met behulp van reverse transcriptase. Dit cDNA is een stabiele kopie van het insulinegen.

2. Het genen wijzigen (optioneel)

* Optimaliseren voor bacteriële expressie: Het insulinegen heeft mogelijk kleine modificaties nodig om ervoor te zorgen dat het optimaal tot expressie wordt gebracht door bacteriën. Dit kan inhouden:

* Codons wijzigen: De genetische code kan enigszins worden gewijzigd om overeen te komen met de voorkeurscodons die door bacteriën worden gebruikt.

* Sites voor beperkingen enzym toevoegen: Dit zorgt voor precieze insertie in het plasmide.

3. Het plasmide voorbereiden

* het plasmide kiezen: Een geschikte plasmide vector is geselecteerd. Dit zijn kleine, cirkelvormige DNA -moleculen die onafhankelijk van bacteriën kunnen repliceren. Ze hebben meestal:

* Oorsprong van replicatie: Met deze sequentie kan het plasmide repliceren in de bacteriecel.

* Antibioticaresistentiegenen: Dit gen zorgt voor selectie van bacteriën die het plasmide dragen.

* Meerdere kloneringssite (MCS): Deze regio bevat een verscheidenheid aan herkenningsplaatsen voor restrictie -enzym, waardoor het insulinegen een eenvoudige invoeging van het insulinegen mogelijk is.

4. Het plasmide snijden en het gen inbrengen

* Beperkingsenzymen: Het plasmide en het insulinegen worden gesneden met behulp van restrictie -enzymen, die specifieke DNA -sequenties herkennen. Dit creëert bijpassende "plakkerige uiteinden" op beide DNA -moleculen.

* ligatie: Het gesneden plasmide en het gemodificeerde insulinegen worden gemengd met DNA -ligase. Dit enzym sluit zich aan bij de plakkerige uiteinden en voegt het insulinegen effectief in het plasmide.

5. Transformerende bacteriën

* Competente cellen: Bacteriën worden "competent" gemaakt om DNA op te nemen. Dit kan inhouden dat ze worden behandeld met calciumchloride of andere methoden.

* Transformatie: Het plasmide dat het insulinegen bevat, wordt geïntroduceerd in de competente bacteriecellen.

* Selectie: Bacteriën die met succes het plasmide hebben opgenomen, worden geselecteerd door ze te platen op een groeimedium dat het antibioticum bevat waar het plasmide weerstand tegen verleent. Alleen die bacteriën die het plasmide hebben, kunnen overleven.

6. Expressie van insuline

* Productie: De getransformeerde bacteriën dragen nu het menselijke insulinegen en expressie, waardoor menselijk insuline -eiwit wordt geproduceerd.

* zuivering: Het insuline -eiwit wordt geëxtraheerd en gezuiverd uit de bacteriecellen.

Samenvattend:

Dit proces zorgt voor grootschalige productie van menselijke insuline, een vitale behandeling voor diabetes. Door de kracht van genetische manipulatie, bacteriële expressiesystemen en rigoureuze zuiveringsmethoden te combineren, kunnen wetenschappers een veilige en effectieve insuline produceren voor miljoenen mensen wereldwijd.