Gisten scheiden niet direct alcohol af. In plaats daarvan produceren ze alcohol als bijproduct van de fermentatie, een proces waarmee ze energie kunnen opwekken zonder zuurstof.

Tijdens de fermentatie zetten gisten glucose om in pyruvaat door middel van glycolyse, vergelijkbaar met aerobe ademhaling. Bij afwezigheid van zuurstof kan pyruvaat echter niet in de citroenzuurcyclus (ook bekend als de Krebs-cyclus) terecht voor verdere energieproductie. Als gevolg hiervan leiden gisten pyruvaat om naar een alternatieve route die bekend staat als fermentatie.

Bij alcoholische gisting wordt pyruvaat gedecarboxyleerd door pyruvaatdecarboxylase, waarbij aceetaldehyde en kooldioxide worden geproduceerd. Aceetaldehyde wordt vervolgens gereduceerd tot ethanol (alcohol) door alcoholdehydrogenase, waarbij NADH wordt gebruikt die tijdens de glycolyse wordt gegenereerd. Door dit proces kunnen gisten NAD+ regenereren die nodig is om de glycolyse voort te zetten, waardoor de cel energie kan blijven produceren door glucose om te zetten in ethanol en koolstofdioxide.

De productie van alcohol tijdens de fermentatie is gunstig voor gisten, omdat het gunstige omstandigheden creëert voor hun overleving. Hierdoor kunnen ze gedijen in omgevingen met beperkte zuurstof, zoals fruit, deeg en dranken, waar ze een cruciale rol spelen bij de voedselproductie en de fermentatie van alcoholische dranken. Bovendien heeft ethanol antimicrobiële eigenschappen, die de groei van concurrerende micro-organismen kunnen remmen, wat een selectief voordeel oplevert voor gisten in bepaalde ecosystemen.