Het is mogelijk om hele organismen zoals Dolly het schaap te klonen, maar DNA-klonen is anders. Het maakt gebruik van moleculaire biologietechnieken om identieke kopieën te maken van DNA-sequenties of afzonderlijke genen.

Met behulp van genetische manipulatiemethoden worden segmenten van de genetische DNA-code geïdentificeerd en geïsoleerd. Klonen van DNA kopieert vervolgens de nucleïnezuursequenties in de segmenten.

De resulterende identieke kopieën kunnen worden gebruikt voor verder onderzoek of voor biotechnologische toepassingen. Vaak codeert het gen dat wordt gekopieerd voor een eiwit dat deel kan uitmaken van medische behandelingen. DNA-technologie inclusief DNA-klonen ondersteunt het begrip van hoe genen werken en hoe de genetische code van mensen de werking van het lichaam beïnvloedt.
DNA-klonen: definitie en procesoverzicht

DNA-klonen is het moleculaire biologieproces van het maken van identieke kopieën van DNA-segmenten in de chromosomen die de genetische code van geavanceerde organismen bevatten.

Het proces genereert grote hoeveelheden van de doel-DNA-sequenties
. Het doel van DNA-klonering is om de doel-DNA-sequenties zelf te produceren of om de eiwitten te produceren die in de doelsequenties worden gecodeerd.

De twee methoden die bij DNA-klonering worden gebruikt, worden plasmidevector
en polymerase kettingreactie (PCR)
. In de plasmidevectormethode worden DNA-strengen geknipt met behulp van restrictie-enzymen
om DNA-fragmenten te produceren, en de resulterende segmenten worden ingevoegd in kloneringsvectoren die plasmiden worden genoemd voor verdere duplicatie. De plasmiden worden in bacteriecellen geplaatst die vervolgens de DNA-kopieën of gecodeerde eiwitten produceren.

In de PCR-methode wordt het te dupliceren segment van DNA-strengen gemarkeerd met enzymen die primers worden genoemd
. Een polymerase-enzym maakt kopieën van het gemarkeerde deel van de DNA-streng. Deze methode maakt geen gebruik van restrictie-enzymen en kan uit kleine monsters gekloond DNA produceren. Soms worden de twee DNA-technologiemethoden samen gebruikt om de beste eigenschappen van elk in een algehele reactie op te nemen.
De Plasmid-vectormethode

De vector van de methode verwijst naar het plasmide dat wordt gebruikt om het doel-DNA-segment te bevatten gekloond worden. Plasmiden zijn kleine cirkelvormige strengen van niet-chromosomaal DNA die in veel organismen worden gevonden, waaronder bacteriën en virussen.

Bacteriële plasmiden zijn de vector die wordt gebruikt voor het invoegen van het doel-DNA-segment in bacteriële cellen voor verdere duplicatie.

Het doel-DNA selecteren en isoleren: Voordat het DNA-kloneringsproces kan beginnen, moeten de DNA-sequenties worden geïdentificeerd, vooral het begin en de uiteinden van de DNA-segmenten.

Dergelijke DNA-sequenties kunnen worden gevonden door bestaand gekloneerd DNA met bekende sequenties te gebruiken of door het eiwit te bestuderen dat door de doel-DNA-sequentie wordt geproduceerd. Zodra de sequentie bekend is, kunnen de overeenkomstige restrictie-enzymen worden gebruikt.

Het doel-DNA knippen met restrictie-enzymen: restrictie-enzymen worden geselecteerd om de DNA-code te zoeken aan het begin en einde van de doelsequenties.

Wanneer de restrictie-enzymen een speciale gecodeerde sequentie van basenparen vinden die restrictieplaatsen worden genoemd, hechten ze zich aan het DNA op die locatie en winden zich rond het DNA-molecuul, waardoor de streng wordt gescheiden. De gesneden DNA-segmenten die de doelsequentie bevatten, zijn nu beschikbaar voor duplicatie.

De plasmidevector kiezen en het doel-DNA invoegen: een geschikt plasmide bevat idealiter dezelfde DNA-coderende sequenties als de DNA-streng waaruit het doel-DNA was besnoeiing. De cirkelvormige DNA-streng van het plasmide wordt gesneden met dezelfde restrictie-enzymen die werden gebruikt voor het knippen van het doel-DNA.

Een DNA-ligase-enzym
wordt gebruikt om DNA-segmentkoppeling te bevorderen, en de uiteinden van het doel-DNA-segment koppelen met de afgesneden uiteinden van het plasmide-DNA. Het doel-DNA maakt nu deel uit van de cirkelvormige plasmide-DNA-streng.

Het plasmide in een bacteriecel invoegen: zodra het plasmide de DNA-sequentie bevat die moet worden gekloond, kan het eigenlijke klonen plaatsvinden met behulp van een proces genaamd bacteriële transformatie
. De plasmiden worden ingebracht in een bacteriecel zoals E. coli, en de cellen met de nieuwe DNA-segmenten zullen kopieën en de overeenkomstige eiwitten gaan produceren.

Bij bacteriële transformatie worden de gastheercellen en plasmiden samen geïncubeerd bij lichaamstemperatuur gedurende ongeveer 12 uur. De cellen absorberen enkele van de plasmiden en behandelen ze als hun eigen plasmide-DNA.

Het gekloonde DNA en eiwitten oogsten: de meeste plasmiden die voor DNA-klonering worden gebruikt, hebben antibioticaresistentiegenen
in hun DNA opgenomen. Naarmate de bacteriecellen de nieuwe plasmiden absorberen, worden ze resistent tegen antibiotica.

Wanneer de kweek met antibiotica wordt behandeld, overleven alleen die cellen die de nieuwe plasmiden hebben geabsorbeerd. Het resultaat is een pure cultuur van bacteriecellen met gekloneerd DNA. Dat DNA kan vervolgens worden geoogst of het bijbehorende eiwit kan worden geproduceerd.
De PCR-methode (Polymerase Chain Reaction)

De PCR-methode is eenvoudiger en kopieert het bestaande DNA. Het vereist geen knippen met restrictie-enzymen of het invoegen van plasmide-DNA-sequenties. Dit maakt het vooral geschikt voor het klonen van DNA-monsters met een beperkt aantal DNA-strengen. Hoewel de methode DNA kan klonen, kan deze niet worden gebruikt voor de productie van het overeenkomstige eiwit.

De DNA-strengen oprollen: DNA in chromosomen is strak opgerold in een dubbele helixstructuur. Door het DNA te verwarmen tot 96 graden Celsius in een proces dat denaturatie wordt genoemd, wordt het DNA-molecuul opgerold en gescheiden in twee strengen. Deze scheiding is vereist omdat slechts een enkele DNA-streng in één keer kan worden gekloond.

De primers selecteren: Net als bij plasmide vector DNA-klonering moeten de te klonen DNA-sequenties worden geïdentificeerd met speciale nadruk op de begin en einde van de DNA-segmenten. Primers zijn enzymen die zich hechten aan specifieke DNA-codesequenties en deze moeten worden geselecteerd om de doel-DNA-segmenten te markeren. De juiste primers hechten zich aan de DNA-molecuulsequenties om het begin en einde van de doelsegmenten te markeren.

De reactie gloeien om de primers te binden: De reactie afkoelen tot ongeveer 55 graden Celsius wordt gloeien genoemd
. Terwijl de reactie afkoelt, worden de primers geactiveerd en hechten ze zich aan de DNA-streng aan elk uiteinde van een doel-DNA-segment. De primers werken alleen als markers en de DNA-streng hoeft niet te worden gesneden.

Productie van identieke kopieën van het doel-DNA-segment: in een proces genaamd extensie
, de warmtegevoelige TAQ polymerase-enzym wordt aan de reactie toegevoegd. De reactie wordt vervolgens verwarmd tot 72 graden Celsius, waardoor het enzym wordt geactiveerd. Het actieve DNA-polymerase-enzym bindt aan de primers en kopieert de DNA-sequentie daartussen. Het initiële DNA-sequencing- en kloneringsproces is voltooid.

De opbrengst van gekloond DNA verhogen: het initiële uitgloeiings- en extensieproces maakt relatief weinig kopieën van de beschikbare DNA-strengsegmenten. Om de opbrengst te verhogen door extra DNA-replicatie, wordt de reactie opnieuw afgekoeld om de primers opnieuw te activeren en te laten binden aan andere DNA-strengen.

Vervolgens wordt de polymerisatie-enzym opnieuw geactiveerd door het opnieuw verwarmen van de reactie en meer kopieën zijn geproduceerd. Deze cyclus kan 25 tot 30 keer worden herhaald.
Gebruik van de plasmidenvector en PCR DNA-kloneringsmethoden samen

De plasmidevectormethode is afhankelijk van een ruime initiële toevoer van DNA om te knippen en in plasmiden in te voegen. Te weinig origineel DNA resulteert in minder plasmiden en een langzame start van gekloneerde DNA-productie.

De PCR-methode kan een grote hoeveelheid DNA produceren uit enkele originele DNA-strengen, maar omdat het DNA niet in een bacteriecel is geïmplanteerd , eiwitproductie is niet mogelijk.

Om het eiwit te produceren dat wordt gecodeerd in de DNA-fragmenten die moeten worden gekloond uit een klein initieel DNA-monster, kunnen de twee methoden samen worden gebruikt en kunnen ze elkaar aanvullen. Eerst wordt de PCR-methode gebruikt om DNA uit een klein monster te klonen en veel kopieën te produceren.

Vervolgens worden de PCR-producten gebruikt met de plasmidevectormethode om het geproduceerde DNA te implanteren in bacteriecellen die het gewenste eiwit produceren.
Voorbeelden van DNA-klonering voor biotechnologie

Moleculaire biologie maakt gebruik van genklonering en DNA-replicatie voor medische en commerciële doeleinden. De bacteriën met gekloonde DNA-sequenties worden gebruikt om medicijnen te produceren en stoffen te vervangen die mensen met genetische aandoeningen niet zelf kunnen produceren.

Typisch gebruik is: