Een gezamenlijk onderzoeksteam onder leiding van Dr. Akira Kunitomi, een voormalig postdoctoraal onderzoeker bij CiRA (momenteel onderzoeker aan het Gladstone Institute of Cardiovascular Disease), en ID Pharma Co., Ltd., heeft de cruciale rol blootgelegd van eicelspecifieke linkerhistone , H1FOO, bij het verbeteren van de herprogrammeringsefficiëntie en homogeniteit voor voorbereide en naïeve pluripotente staten. Het onderzoek is gepubliceerd in Stem Cell Reports .

Terwijl conventionele herprogrammering door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) produceert met "primed" kenmerken, die lijken op post-implantatie epiblasten met een beperkt potentieel om in extra-embryonale weefsels te veranderen, vertoont de "naïeve" pluripotente toestand eigenschappen die meer lijken op epiblastcellen van vóór implantatie en iPS-cellen van muizen. , waardoor ze zich kunnen differentiëren in zowel embryonale als extra-embryonale lijnen.

Hoewel geprimede en naïeve menselijke iPS-cellen biomedische vooruitgang mogelijk hebben gemaakt die voorheen ondenkbaar was, is hun heterogeniteit een van de belangrijkste uitdagingen voor iPS-cellen voor fundamenteel onderzoek en medische doeleinden. Traditionele herprogrammeringsmethoden blijven een stochastisch proces en daarom blijven veel onderzoekers zoeken naar efficiëntere en preciezere manieren om homogene iPS-cellen te genereren.

In hun recente onderzoek onderzocht het collaboratieve onderzoeksteam het potentieel van de moederspecifieke linker histone H1FOO als een kandidaatfactor om het herprogrammeringsproces te verfijnen. De onderzoekers ontwikkelden H1FOO door er een destabilisatiedomein (DD) aan toe te voegen, zodat ze de afbraak ervan chemisch konden manipuleren en de niveaus ervan zorgvuldig konden reguleren.

Bij gebruik in combinatie met de Yamanaka-factoren (OSKL, MYC werd vervangen door LMYC om tumorigenese te voorkomen) ontdekten ze dat H1FOO-DD de efficiëntie van iPS-celgeneratie aanzienlijk verbeterde, ongeacht het gebruikte genafgiftesysteem.

Hoewel genexpressie en epigenetische analyses geen betekenisvolle verschillen aan het licht brachten tussen herprogrammering met alleen OSKL of in combinatie met H1FOO-DD, onthulden ze wel dat door het gebruik van H1FOO-DD de onafhankelijk gegenereerde iPS-cellen een meer vergelijkbaar genexpressiepatroon vertoonden. , wat wijst op verbeteringen op het gebied van homogeniteit en reproduceerbaarheid.

Met name een analyse van genen met zeer variabele expressie tussen onafhankelijke iPS-cellijnen suggereerde dat H1FOO deze variabiliteit met bijna de helft verminderde. Cruciaal is dat veel van deze genen betrokken zijn bij de regulering van genexpressie, wat het vermogen van H1FOO-DD aantoont om het herprogrammeringsproces strenger te begeleiden.

Bovendien merkten de onderzoekers ook op dat iPS-cellen gegenereerd via herprogrammering met H1FOO-DD beter waren in het differentiëren in endoderm, een van de drie primaire kiemlagen, en hartspiercellen (een mesodermaal celtype).

Het onderzoeksteam zette hun onderzoek voort door de onderliggende mechanismen te onderzoeken waarmee H1FOO-DD de herprogrammering verbetert. Door single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analyse ontdekten de onderzoekers dat herprogrammering met H1FOO-DD niet alleen leidde tot eerdere en hogere expressie van pluripotentie-gerelateerde genen, maar ook de expressie onderdrukte van genen die verband houden met aangeboren immuunrespons, ontsteking en apoptose (geprogrammeerde celdood).

Met name H1FOO-DD verhoogde het aantal cellen dat werd gecategoriseerd als succesvol geherprogrammeerd, terwijl het aantal celsubpopulaties verminderde waarvan werd aangenomen dat ze onvolledige of niet-succesvolle herprogrammering hadden ondergaan.

Gezien de rol van H1FOO als factor voor het hermodelleren van chromatine, onderzochten de onderzoekers ook de toegankelijkheid van chromatinegebieden. In overeenstemming met de bevindingen uit genexpressieanalyse gingen chromatinegebieden, vooral de nabijgelegen pluripotentiemarkers, eerder open en waren ze beter toegankelijk toen H1FOO-DD werd opgenomen als een herprogrammeringsfactor.

Verdere analyse toonde aan dat POU- en KLF/SP-transcriptiefactorfamilies eerder tijdens het herprogrammeringsproces door H1FOO-DD werden geactiveerd. Deze resultaten suggereren dat H1FOO-DD helpt bij het efficiënter en tijdiger coördineren van herprogrammering om de generatie van iPS-cellen te verbeteren.

De onderzoekers concentreerden zich vervolgens op stroomafwaartse effectoren die helpen de positieve effecten van H1FOO-DD op de generatie van iPS-cellen te mediëren door genen met differentiële expressie al vroeg tijdens het herprogrammeren te onderzoeken. Door deze analyse identificeerden ze 19 opgereguleerde en twee gedownreguleerde genen toen H1FOO-DD werd opgenomen als een herprogrammeringsfactor.

Het onderzoeksteam onderzocht deze genen afzonderlijk om te bepalen of ze de geprimede en naïeve herprogrammering beïnvloeden en ontdekte dat overexpressie van FKBP1A of APOE de herprogrammering verbetert. Omdat eerder werd gerapporteerd dat APOE sterk tot uiting kwam tijdens herprogrammering, richtten de onderzoekers hun aandacht op FKBP1A in de hoop nieuwe moleculaire mechanismen te onthullen die ten grondslag liggen aan succesvolle herprogrammering.

Ze ontdekten met name dat herprogrammering met alleen OSKL de FKBP1A-expressie verhoogt, maar dat de opname van H1FOO-DD deze dramatisch verbetert. Deze observatie werd verder ondersteund door het opnieuw onderzoeken van de genexpressie- en chromatinetoegankelijkheidsgegevens die ze al hadden verzameld.

FKBP1A is een immunofiline dat betrokken is bij immunosuppressie en kan interageren met TGFBR1 en deze remmen, wat op zijn beurt de mesenchymale-naar-epitheliale transitie (MET) bevordert en de herprogrammeringsefficiëntie verbetert.

De onderzoekers veronderstelden daarom dat zowel FKBP1A-functies bij het onderdrukken van de aangeboren immuniteit als het remmen van TGFBR1-gemedieerde MET) waarschijnlijk verantwoordelijk zijn voor de verbetering van de herprogrammeringsefficiëntie door H1FOO-DD.

Ze ontdekten met name dat herprogrammering via een combinatie van overexpressie van OSKL en FKBP1A leidde tot vergelijkbare TGFBR1-onderdrukking, MET-verbetering, onderdrukking van de aangeboren immuunrespons en apoptose, zoals wanneer H1FOO-DD werd gebruikt om herprogrammering te initiëren.

Omdat eerdere analyse van genexpressie aangaf dat H1FOO-DD niet alleen de geprimede herprogrammering versterkte, maar ook de expressie van naïeve toestandsmarkers induceerde, onderzochten de onderzoekers ten slotte of H1FOO-DD ook in staat is herprogrammering naar de naïeve toestand te bevorderen. Ze merkten inderdaad op dat de opname van H1FOO-DD de generatie van naïeve iPS-cellen aanzienlijk verbeterde.

Bovendien versterkte H1FOO-DD, analoog aan geprimede herprogrammering, het herprogrammeringsproces door een meer uniforme gen- en epigenetische regulatie in de cellen te coördineren. Functioneel, zoals gemeten aan de hand van metabolische activiteit en X-chromosoomreactivatie, produceerde herprogrammering met behulp van H1FOO-DD naïeve iPS-cellen die meer leken op naïeve embryonale stamcellen of pre-implantatieblastocysten dan wanneer OSKL alleen werd gebruikt.

Samenvattend hebben de gezamenlijke inspanningen van het gezamenlijke onderzoeksteam de H1FOO-FKBP1A-as geïdentificeerd als een middel om cellen met grotere efficiëntie en precisie te herprogrammeren. Deze bevindingen zullen een enorme impact blijken te hebben op de generatie van iPS-cellen voor zowel fundamenteel wetenschappelijk onderzoek als klinische toepassingen.

Meer informatie: Akira Kunitomi et al, H1FOO-DD bevordert efficiëntie en uniformiteit bij herprogrammering tot naïeve pluripotentie, Stamcelrapporten (2024). DOI:10.1016/j.stemcr.2024.04.005

Journaalinformatie: Stamcelrapporten

Aangeboden door de Universiteit van Kyoto