Bij gelelektroforese worden monsters van DNA of eiwitten gescheiden - meestal op basis van grootte - door een elektrisch veld aan te leggen waardoor ze door een gel migreren. Het gebruik van gelelektroforese is routine in biomedische onderzoekslaboratoria en wordt gebruikt om een ​​verscheidenheid aan verschillende vragen te beantwoorden, dus er is niet echt een universele manier om de resultaten te analyseren. Verschillende technieken zoals Western-blotting, Northern-blotting en Southern-blotting omvatten bijvoorbeeld allemaal gelelektroforese. Als u agarosegelelektroforese van DNA-monsters, de meest gebruikelijke procedure, uitvoert, moet u doorgaans ten minste twee dingen doen: 1) ongesneden plasmiden onderscheiden van inserts, nicked plasmiden en gesneden plasmiden en 2) de grootte schatten van de verschillende DNA-fragmenten. Zo werkt het.

Controleer uw labotebook om te bepalen welke samples in welke rijstroken zijn geladen. Wanneer u de wells voor uw gel hebt geladen, moet u de identiteit van elke rijstrook /monster hebben genoteerd.

Bepaal welke baan de "ladder" van DNA-standaarden bevat. Dit zijn fragmenten van bekende lengte; hun migratieafstand kan worden gebruikt om de grootte van de voorbeeldfragmenten te bepalen.

Meet met behulp van een liniaal de afstand op uw foto van de wells naar de trackingkleurstof, die verder is gereisd dan een van de DNA-banden (met andere woorden, het zal onderaan de gel zijn). Noteer dit nummer - de eenheden die u gebruikt zijn niet belangrijk.

Meet de afstand op uw foto van de wells naar elk van de banden in de "ladder" en deel die afstand vervolgens over de afstand afgelegd door de het volgen van kleurstofband. Deze berekening geeft je de relatieve mobiliteit van elke band.

Voorbeeld: Stel dat de trackingkleurstofband 6 inch heeft afgelegd en we hebben drie banden die 5, 4,5 en 3,5 inch hebben afgelegd. Wat is hun relatieve mobiliteit? Antwoord: we verdelen 5, 4.5 en 3.5 door 6 om relatieve mobiliteiten van 0.833, 0.75 en 0.5833 te verkrijgen.

Voer de relatieve mobilities in uw spreadsheetprogramma (Excel of een ander soortgelijk programma dat u gebruikt) samen met de grootte in kilobasen van elk fragment in de ladder. (De fabrikant geeft je de grootte van elk fragment in de ladders die ze leveren, dus je zou deze informatie al moeten hebben.)

Grafiek de gegevens met relatieve mobiliteit op x en grootte in kilobasen op de y.

Gebruik de Trendline-functie in uw spreadsheetprogramma om een ​​vergelijking aan te passen aan de gegevens. Deze vergelijking moet een machtsvergelijking zijn (bijvoorbeeld x ^ -2) en moet relatief goed passen in de gegevens (R-coëfficiënt van minimaal 0,9).

Kijk naar de banden die overeenkomen met uw voorbeelden. Bedenk dat kleinere DNA-fragmenten verder door de gel reizen dan grote DNA-fragmenten, zodat degenen die zich het dichtst bij de trackingkleurstof bevinden, de kleinste zijn. Merk echter op dat als plasmide (circulair) DNA niet wordt gesneden, het "supercoiled" of gedraaid wordt als een telefoonsnoer, waardoor het feitelijk FARTHER zal afleggen dan lineair DNA van dezelfde grootte. Evenzo zal een "afgekapt" plasmide dat onvolledig is gesneden, een kortere afstand afleggen dan lineair DNA van dezelfde grootte. Daarom kunt u de grootte van ongesneden plasmiden niet schatten op basis van uw gel.

Vergelijk de banden in elke rij met de identiteit van het monster dat u in die rij hebt geladen en bepaal of wat u ziet, is wat u zou verwachten . Dit is afhankelijk van de aard van uw experiment. Als u echter een insert-plasmide met twee restrictie-enzymen verteerde, zou u in het algemeen verwachten dat het insert van het plasmide zou worden bevrijd; omdat het veel kleiner is dan het plasmide, zou je verwachten dat er twee banden in die baan te zien zijn, een in de buurt van de bovenkant en de andere in de buurt van de bodem. Een plasmide dat is geknipt met slechts één restrictie-enzym, mag slechts een enkele band vormen die een beetje verder weg is dan het plasmide dat is geknipt met twee restrictie-enzymen, maar nergens dichtbij tot aan het insert.

Meet de afstand van de wells tot het gesneden plasmide en voeg banden in met je liniaal. Deel deze getallen door de afstand afgelegd door de volgkleurstof om de relatieve mobiliteit van inserts en gesneden plasmiden te vinden.

Plug de relatieve mobiliteit van inserts en gesneden plasmiden in de vergelijking die uw spreadsheetprogramma voor u heeft berekend. Deze berekening moet u een schatting geven van de grootte van deze plasmiden.

Tip

Als u heldere, brede banden op de bodem van elke baan ziet, hebt u waarschijnlijk wat RNA in uw gel - uw zuiveringsprotocol is mogelijk gebrekkig.