Cellen waargenomen op een dia geplaatst onder een microscoop worden geteld met behulp van een gemeenschappelijk laboratoriuminstrument dat bekend staat als een hemacytometer of een cel-telkamer, in combinatie met een exclusiekleurstof Trypan-blauw. De kleurstof kleurt dode cellen blauw, maar kan geen levende cellen binnenkomen, die door het microscoopoculair als heldere, witte bollen verschijnen. Wetenschappers moeten cellen tellen om het juiste aantal cellen in een celcultuurmedium of experimentele reagens te plaatsen voor kwantificering en analyse of gewoon om te voorkomen dat cellen overgroeien.

Bepaal het type hemacytometer (bijv. Neubauer) gebruikt worden. Dit zijn eigenlijk dikke microscoopglaasjes met een centraal gedeelte geëtst met telnetten. Plaats dit onder de microscoop ingesteld op een lage vergroting (10-20X) en pas de focus van de lenzen aan totdat invidivuele telnetten zichtbaar zijn.

Bereid een celsuspensie voor. Gebruik het enzym trypsine om het weefsel op te splitsen in afzonderlijke cellen en neutraliseer vervolgens de trypsine met serum. Was en pellet de cellen en resuspendeer in media of zoutoplossing. Elimineer celmassa's door zachtjes op en neer te pipetteren. Als de suspensie troebel lijkt, verdunt u dit verder met meer zoutoplossing.

Gebruik Trypan blauw om dode cellen uit te sluiten. Breng 10-20 microliter celsuspensie over in een steriele buis en meng met exact hetzelfde volume Trypan-blauwe kleurstof door voorzichtig te pipetteren. Dit verdunt de celsuspensie 1: 2 in Trypan-blauw.

Bereid de hemactymeter voor. Veeg met 70% ethanol, laat aan de lucht drogen en plaats een dekglaasje over de telnetten. In de \\ "afvoer \\" aan de bovenkant van elk rooster plaatst u 10 microliter celsuspensie en laat u de \\ "afvoer" onder het dekglaasje trekken. Herhaal dit voor dit andere telpatroon totdat beide een gelijkmatige laag celsuspensie hebben.

Tel het aantal cellen met behulp van de handmatige teller. Levende cellen reflecteren licht en zien er glanzend, witachtig en bolvormig uit. Cellen die blauw zijn, zijn dood of beschadigd en moeten niet worden geteld, tenzij niet-levensvatbare celaantallen vereist zijn. Herhaal dit voor alle 8 telnetten en neem vervolgens het gemiddelde. Als 800 cellen bijvoorbeeld worden geteld in 8 rasters, is het gemiddelde per raster 100 cellen.

Bereken de celdichtheid in de oorspronkelijke opschorting. Pas het gemiddelde aantal cellen toe op de volgende formule: Celconcentratie = Gemiddeld aantal cellen X 10.000 X verdunningsfactor (= 2, als de verdunning 1: 2 is) X volume suspensie (in milliliters, indien nodig aanpassen voor microliters enzovoort) ).

Reinig de hemacytometer. Was de celsuspensie af, veeg de hemacytometer af met bleekwater en /of 70% isopropanol of laat overstromen met 70% ethanol. Laat drogen of droogwrijven met een pluisvrije doek en gooi alle ongewenste celsuspensies weg in bio-gevaarlijke containers.

Waarschuwing

Trypan-blauw is een mutageen en vlekken permanent, dus zorg voor beschermende kleding en handschoenen worden gedragen voordat u verdergaat.