science >> Wetenschap >  >> Biologie

Hoe wordt DNA gevisualiseerd met behulp van gelelektroforese?

Voor deze visualisatietechniek wordt ethidiumbromide vóór de elektroforese gemengd met agarosepoeder, EDTA-buffer en water om de gelmatrix te vormen. Dientengevolge worden de ethidiumbromide-moleculen gelijkmatig door de matrix gedispergeerd. Nadat de putjes van de gel zijn gevuld met hun respectieve DNA-monsters en volgkleurstoffen, wordt spanning aangelegd om de grote polaire verbindingen langzaam over de matrix te trekken.

Tijdens deze beweging binden de basen van de DNA-moleculen tijdelijk aan de ethidiumbromide deeltjes, slepen ze mee. Tegen de tijd dat de elektroforese is voltooid, heeft elk DNA-molecuul een aanzienlijke hoeveelheid ethidiumbromide opgenomen.

In aanwezigheid van ultraviolet licht vertoont ethidiumbromide fluorescentie. Technici schijnen een speciaal gekalibreerd UV-licht over de gel terwijl een machine het beeld van de gloeiende fragmenten vastlegt.

Methyleenblauw

Als een UV-transilluminator niet beschikbaar of praktisch is, kunnen technici DNA maken zichtbaar onder normale omstandigheden door de gerede agarosegel te drenken, met binnenin een oplossing van methyleenblauw, met geëlektroforeerd DNA.

Een chloridezout met een aanzienlijk hydrofoob anion, methyleenblauwmoleculen dringen door de gehele gelmatrix. De waterstofbinding in heel DNA zorgt er echter voor dat de vlekmoleculen zich ophopen. Deze verhoogde vlekdichtheid rond het DNA geeft een diepere tint blauw, zichtbaar voor het blote oog.

Kleurstoffen bijhouden

Naast de relatieve grootte van de DNA-banden, kunnen technici de absolute grootte meten ( in baseparen) van elk fragment met behulp van chemicaliën die spoorkleurstoffen worden genoemd. Zichtbaar zonder de toevoeging van methyleenblauw of ethidiumbromide, volgen volgkleurstoffen zoals broomfenolblauw en xyleencyanol tijdens de elektroforese over de aragosegelmatrices met dezelfde snelheid als DNA-fragmenten bestaande uit respectievelijk 300 nucleotiden en 4000 nucleotiden. Bij elektroforese reizen meer massieve DNA-fragmenten met een lagere snelheid door de gelmatrix dan kleinere fragmenten. Daarom, terwijl het volgen van kleurstoffen de zichtbaarheid van DNA-fragmenten niet direct beïnvloedt, kunnen technici het aantal nucleotiden van het DNA-fragment "zien" bij het vergelijken van de positie van een DNA-fragment in de gel tot de positie van deze kleurstoffen.