Een spectrofotometer wordt gebruikt om de concentratie van bepaalde verbindingen, zoals eiwit, in een oplossing te bepalen. Over het algemeen schijnt een licht door een cuvette gevuld met een monster. De hoeveelheid licht die door het monster wordt geabsorbeerd, wordt gemeten. Omdat verbindingen licht absorberen in verschillende spectrale bereiken, moet de juiste golflengte worden ingesteld voor de analyse. Er zijn verschillende manieren om de concentratie van onbekende monsters door middel van spectrofotometrie te berekenen, maar het gebruik van referentiestandaarden geeft de beste nauwkeurigheid. Verder geven normen ook aan of de spectrofotometer slecht functioneert of andere problemen met de analyse.

Berekenen door middel van rechte lijnvergelijkingen

Analyseer referentiestandaarden aan het begin van de analyse. Normen zijn bekende concentraties en worden gebruikt om apparatuur te kalibreren en de nauwkeurigheid te controleren. Alle monsters moeten binnen het werkbereik van de normen vallen. Als dat niet het geval is, moeten de monsters worden verdund of de concentratie van normen worden verhoogd.

Maak een spreidingsdiagram of lijngrafiek met standaardconcentratie- en absorptiewaarden. De concentratie bevindt zich op de y-as, het absorptievermogen op de x-as. De standaarden zijn bijvoorbeeld 1 ppm, 2,5 ppm en 5 ppm. De gegeven absorptie was 1 ppm = 0,25, 2,5 ppm = 0,5 en 5 ppm = 0,75.

Formatteer de trendlijn om een ​​vergelijking in de grafiek weer te geven. De vergelijking toont de formule y = mx + b. Als u bijvoorbeeld de standaarden in stap 2 gebruikt, is de vergelijking y = .1224x + 0.1531. De meeste trendlijnen worden bij nul onderschept, maar dit is afhankelijk van de analysemethode en de R-kwadraatwaarde.

Analyseer onbekende steekproeven en meet de absorptiemetingen.

Gebruik de vergelijking (y = mx + b ) om concentratie van monsters te bepalen.

Wat is rechte vergelijking?

Laat "Y" gelijk zijn aan de concentratie. Dit is wat zal worden opgelost.

Laat "X" gelijk zijn aan het absorptievermogen van het monster. Dit is het absorptievermogen gemeten door de spectrofotometer.

Sta toe dat "" gelijk is aan de helling en "b" gelijk aan het y-snijpunt. Beide worden gegeven, maar als de trendlijn door 0 is gehaald, wordt 'b' 0.

Los de concentratie op. Gebruik het voorbeeld in stap 3 en vervang "x" als een gegeven absorptievermogen van .563. Daarom:

y = .1224 (.563) + 0.1531

y (concentratie) = .222011

Tip

De eenheden van de concentratie zullen hetzelfde zijn als de normen. Bijvoorbeeld, eenheden zijn delen per miljoen (ppm) of delen per miljard (ppb).

Referentiestandaarden en voorbeelden zijn gemakkelijk vervuild.

Waarschuwing

Lees altijd alle onderdelen van assay of methode voor ontwikkeling.