We leven in een wereld gemaakt en gerund door RNA, de even belangrijke broer of zus van het genetische molecuul DNA. In feite veronderstellen evolutionaire biologen dat RNA al bestond en zichzelf repliceerde zelfs vóór het verschijnen van DNA en de eiwitten die erdoor worden gecodeerd. Snel vooruit naar de moderne mens:de wetenschap heeft onthuld dat minder dan 3% van het menselijk genoom wordt getranscribeerd in messenger-RNA (mRNA) -moleculen die op hun beurt worden vertaald in eiwitten. Daarentegen wordt 82% ervan getranscribeerd in RNA-moleculen met andere functies, waarvan er vele nog steeds raadselachtig zijn.

Om te begrijpen wat een individueel RNA-molecuul doet, moet de 3D-structuur worden ontcijferd op het niveau van de samenstellende atomen en moleculaire bindingen. Onderzoekers hebben routinematig DNA- en eiwitmoleculen bestudeerd door ze te veranderen in regelmatig opeengepakte kristallen die kunnen worden onderzocht met een röntgenstraal (röntgenkristallografie) of radiogolven (nucleaire magnetische resonantie). Deze technieken kunnen echter niet met bijna dezelfde effectiviteit op RNA-moleculen worden toegepast, omdat hun moleculaire samenstelling en structurele flexibiliteit voorkomen dat ze gemakkelijk kristallen vormen.

Nu, een onderzoekssamenwerking onder leiding van Wyss Core Faculty-lid Peng Yin, Ph.D. aan het Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering aan de Harvard University, en Maofu Liao, Ph.D. aan de Harvard Medical School (HMS), heeft een fundamenteel nieuwe benadering van het structurele onderzoek van RNA-moleculen gerapporteerd. ROCK, zoals het wordt genoemd, gebruikt een RNA-nanotechnologische techniek waarmee het meerdere identieke RNA-moleculen kan assembleren tot een sterk georganiseerde structuur, die de flexibiliteit van individuele RNA-moleculen aanzienlijk vermindert en hun molecuulgewicht vermenigvuldigt. Toegepast op bekende model-RNA's met verschillende groottes en functies als benchmarks, toonde het team aan dat hun methode de structurele analyse van de aanwezige RNA-subeenheden mogelijk maakt met een techniek die bekend staat als cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM). Hun vooruitgang wordt gerapporteerd in Natuurmethoden .

"ROCK doorbreekt de huidige grenzen van RNA-structureel onderzoek en maakt het mogelijk om 3D-structuren van RNA-moleculen te ontsluiten die moeilijk of onmogelijk toegankelijk zijn met bestaande methoden en met een bijna-atomaire resolutie", zei Yin, die samen met Liao het onderzoek leidde. . "We verwachten dat deze vooruitgang veel gebieden van fundamenteel onderzoek en medicijnontwikkeling zal stimuleren, inclusief het ontluikende veld van RNA-therapieën." Yin is ook een leider van het Molecular Robotics Initiative van het Wyss Institute en professor in de afdeling Systeembiologie van HMS.

Controle krijgen over RNA

Het team van Yin van het Wyss Institute heeft verschillende benaderingen ontwikkeld waarmee DNA- en RNA-moleculen zichzelf kunnen assembleren tot grote structuren op basis van verschillende principes en vereisten, waaronder DNA-stenen en DNA-origami. Ze veronderstelden dat dergelijke strategieën ook zouden kunnen worden gebruikt om natuurlijk voorkomende RNA-moleculen te assembleren tot zeer geordende cirkelvormige complexen waarin hun vrijheid om te buigen en te bewegen sterk wordt beperkt door ze specifiek aan elkaar te koppelen. Veel RNA's vouwen op complexe maar voorspelbare manieren, waarbij kleine segmenten basenparen met elkaar. Het resultaat is vaak een gestabiliseerde "kern" en "stam-lussen" die uitpuilen in de periferie.

"In onze aanpak installeren we 'kissing loops' die verschillende perifere stengellussen die tot twee kopieën van een identiek RNA behoren, op een manier met elkaar verbinden dat een algehele gestabiliseerde ring kan worden gevormd, die meerdere kopieën van het RNA van belang bevat," zei Di Liu, Ph.D., een van de twee eerste auteurs en een postdoctoraal onderzoeker in de groep van Yin. "We speculeerden dat deze ringen van hogere orde konden worden geanalyseerd met hoge resolutie door cryo-EM, dat met het eerste succes op RNA-moleculen was toegepast."

Gestabiliseerd RNA in beeld brengen

In cryo-EM worden veel afzonderlijke deeltjes bij cryogene temperaturen ingevroren om verdere bewegingen te voorkomen, en vervolgens gevisualiseerd met een elektronenmicroscoop en met behulp van computeralgoritmen die de verschillende aspecten van de 2D-oppervlakteprojecties van een deeltje vergelijken en de 3D-architectuur reconstrueren . Peng en Liu werkten samen met Liao en zijn voormalige afgestudeerde student François Thélot, Ph.D., de andere co-eerste auteur van de studie. Liao heeft met zijn groep belangrijke bijdragen geleverd aan het snel voortschrijdende cryo-EM-veld en de experimentele en computationele analyse van afzonderlijke deeltjes gevormd door specifieke eiwitten.

"Cryo-EM heeft grote voordelen ten opzichte van traditionele methoden bij het zien van details met hoge resolutie van biologische moleculen, waaronder eiwitten, DNA's en RNA's, maar de kleine omvang en bewegingsneiging van de meeste RNA's voorkomen een succesvolle bepaling van RNA-structuren. Onze nieuwe methode voor het assembleren van RNA-multimeren lost deze twee problemen tegelijkertijd op door de grootte van RNA te vergroten en de beweging ervan te verminderen", zegt Liao, die ook universitair hoofddocent celbiologie is bij HMS. "Onze aanpak heeft de deur geopend voor snelle structuurbepaling van veel RNA's door cryo-EM." De integratie van RNA-nanotechnologie en cryo-EM-benaderingen bracht het team ertoe hun methode "RNA-oligomerisatie-enabled cryo-EM via installatie van kissing loops" (ROCK) te noemen.

Om ROCK proof-of-principle te leveren, concentreerde het team zich op een groot intron-RNA van Tetrahymena, een eencellig organisme, en een klein intron-RNA van Azoarcus, een stikstofbindende bacterie, evenals de zogenaamde FMN-riboswitch . Intron-RNA's zijn niet-coderende RNA-sequenties verspreid over de sequenties van vers getranscribeerde RNA's en moeten worden "gesplitst" om het rijpe RNA te genereren. De FMN-riboswitch wordt aangetroffen in bacteriële RNA's die betrokken zijn bij de biosynthese van flavinemetabolieten afgeleid van vitamine B2. Na binding van een van hen, flavine-mononucleotide (FMN), verandert het zijn 3D-conformatie en onderdrukt het de synthese van zijn moeder-RNA.

"De assemblage van het Tetrahymena-groep I-intron in een ringachtige structuur maakte de monsters homogener en maakte het gebruik van computerhulpmiddelen mogelijk die gebruik maakten van de symmetrie van de geassembleerde structuur. Hoewel onze dataset relatief bescheiden van omvang is, lieten de aangeboren voordelen van ROCK ons toe om de structuur op te lossen met een ongekende resolutie", zei Thélot. "De kern van het RNA is opgelost op 2,85 Å [één Ångström is één tien miljard (VS) van een meter en de geprefereerde metriek die wordt gebruikt door structurele biologen], waardoor gedetailleerde kenmerken van de nucleotidebasen en suikerruggengraat worden onthuld. Ik denk niet dat we had er kunnen komen zonder ROCK - of in ieder geval niet zonder aanzienlijk meer middelen."

Cryo-EM is ook in staat moleculen in verschillende toestanden vast te leggen als ze bijvoorbeeld hun 3D-conformatie veranderen als onderdeel van hun functie. Door ROCK toe te passen op het Azoarcus-intron-RNA en de FMN-riboswitch, slaagde het team erin om de verschillende conformaties te identificeren waar het Azoarcus-intron doorheen gaat tijdens zijn zelfsplitsingsproces, en om de relatieve conformationele stijfheid van de ligandbindingsplaats van de FMN-riboswitch te onthullen .

"Deze studie van Peng Yin en zijn medewerkers laat op elegante wijze zien hoe RNA-nanotechnologie kan werken als een versneller om andere disciplines vooruit te helpen. Het kunnen visualiseren en begrijpen van de structuren van veel natuurlijk voorkomende RNA-moleculen kan een enorme impact hebben op ons begrip van veel biologische en pathologische processen in verschillende celtypen, weefsels en organismen, en maken zelfs nieuwe benaderingen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen mogelijk", zegt Wyss Founding Director Donald Ingber, M.D., Ph.D. + Verder verkennen

Nieuwe inzichten in de structuren en mechanismen van belangrijke eiwitten die betrokken zijn bij microbiële fotosynthese