Ingenieurs van Duke University hebben aangetoond dat zilveren kubussen met nanogrootte diagnostische tests die op fluorescentie berusten, gemakkelijker leesbaar kunnen maken door ze meer dan 150 keer helderder te maken. Gecombineerd met een opkomend point-of-care diagnostisch platform waarvan al is aangetoond dat het kleine sporen van virussen en andere biomarkers kan detecteren, de aanpak zou het mogelijk kunnen maken dat dergelijke tests veel goedkoper en meer verspreid worden.

De resultaten verschenen op 6 mei online in het tijdschrift Nano-letters .

Plasmonica is een wetenschappelijk veld dat energie opsluit in een feedbacklus, een plasmon genaamd, op het oppervlak van zilveren nanokubussen. Wanneer fluorescerende moleculen tussen een van deze nanokubussen en een metalen oppervlak worden geplaatst, de interactie tussen hun elektromagnetische velden zorgt ervoor dat de moleculen veel krachtiger licht uitstralen. Maiken Mikkelsen, de James N. en Elizabeth H. Barton Associate Professor of Electrical and Computer Engineering aan Duke, werkt al bijna tien jaar samen met haar laboratorium in Duke aan het creëren van nieuwe soorten hyperspectrale camera's en supersnelle optische signalen met behulp van plasmonics.

Tegelijkertijd, onderzoekers in het laboratorium van Ashutosh Chilkoti, de Alan L. Kaganov Distinguished Professor in Biomedical Engineering, gewerkt aan een op zichzelf staand, point-of-care diagnostische test die sporen van specifieke biomarkers uit biomedische vloeistoffen zoals bloed kan halen. Maar omdat de tests afhankelijk zijn van fluorescerende markers om de aanwezigheid van de biomarkers aan te geven, het vage licht van een nauwelijks positieve test zien vereist dure en omvangrijke apparatuur.

"Ons onderzoek heeft al aangetoond dat plasmonica de helderheid van fluorescerende moleculen tienduizenden keren kan verbeteren, " zei Mikkelsen. "Het was duidelijk een zeer opwindend idee om het te gebruiken om diagnostische tests te verbeteren die beperkt zijn door hun fluorescentie."

"Er zijn niet veel voorbeelden van mensen die plasmon-versterkte fluorescentie gebruiken voor point-of-care-diagnostiek, en de weinige die er zijn, zijn nog niet geïmplementeerd in de klinische praktijk, " voegde Daria Semeniak toe, een afgestudeerde student in het laboratorium van Chilkoti. "Het heeft ons een paar jaar gekost, maar we denken dat we een systeem hebben ontwikkeld dat kan werken."

In de nieuwe krant onderzoekers van het Chilkoti-lab bouwen hun supergevoelige diagnostische platform genaamd de D4-assay op een dunne film van goud, de yin die de voorkeur heeft boven de yang van de plasmonische zilveren nanocube. Het platform begint met een dunne laag polymeerborstelcoating, die voorkomt dat er iets aan het gouden oppervlak blijft kleven dat de onderzoekers daar niet willen plakken. De onderzoekers gebruiken vervolgens een inkjetprinter om twee groepen moleculen te bevestigen die zijn afgestemd op de biomarker die de test probeert te detecteren. Eén set is permanent aan het gouden oppervlak bevestigd en vangt een deel van de biomarker op. De andere wordt van het oppervlak afgewassen zodra de test begint, hecht zich aan een ander stuk van de biomarker, en knippert licht om aan te geven dat het zijn doel heeft gevonden.

Nadat er enkele minuten zijn verstreken om de reacties te laten plaatsvinden, de rest van het monster wordt weggespoeld, en laten alleen de moleculen achter die erin zijn geslaagd om hun biomarker-matches te vinden, zwevend als fluorescerende bakens vastgebonden aan een gouden vloer.

"De echte betekenis van de test is de coating van de polymeerborstel, "zei Chilkoti. "De polymeerborstel stelt ons in staat om alle gereedschappen die we nodig hebben op de chip op te slaan met behoud van een eenvoudig ontwerp."

Hoewel de D4-assay erg goed is in het opsporen van kleine sporen van specifieke biomarkers, als er alleen sporenhoeveelheden zijn, de fluorescerende bakens kunnen moeilijk te zien zijn. De uitdaging voor Mikkelsen en haar collega's was om hun plasmonische zilveren nanokubussen zo boven de bakens te plaatsen dat ze de fluorescentie van de bakens aanjagen.

Maar zoals meestal het geval is, dit was makkelijker gezegd dan gedaan.

"De afstand tussen de zilveren nanoblokjes en de gouden film bepaalt hoeveel helderder het fluorescerende molecuul wordt, " zei Daniela Cruz, een afgestudeerde student die in het laboratorium van Mikkelsen werkt. "Onze uitdaging was om de polymeerborstelcoating dik genoeg te maken om de biomarkers te vangen - en alleen de biomarkers van belang - maar dun genoeg om de diagnostische lichten nog steeds te verbeteren."

De onderzoekers probeerden dit Goudlokje-raadsel op twee manieren op te lossen. Ze voegden eerst een elektrostatische laag toe die zich bindt aan de detectormoleculen die de fluorescerende eiwitten dragen, het creëren van een soort "tweede verdieping" waar de zilveren nanokubussen bovenop konden zitten. Ze probeerden ook de zilveren nanokubussen te functionaliseren, zodat ze een-op-een rechtstreeks aan individuele detectormoleculen zouden blijven kleven.

Hoewel beide benaderingen erin slaagden de hoeveelheid licht afkomstig van de bakens te vergroten, de eerste liet de beste verbetering zien, het verhogen van de fluorescentie door meer dan 150 keer. Echter, deze methode vereist ook een extra stap van het creëren van een "tweede verdieping, " wat nog een hindernis toevoegt aan het ontwikkelen van een manier om dit te laten werken op een commerciële point-of-care-diagnose in plaats van alleen in een laboratorium. En hoewel de fluorescentie niet zo veel verbeterde bij de tweede benadering, de nauwkeurigheid van de test deed het.

"Het bouwen van microfluïdische lab-on-a-chip-apparaten via beide benaderingen zou tijd en middelen vergen, maar in theorie zijn ze allebei te doen, " zei Cassio Fontes, een afgestudeerde student in het Chilkoti-laboratorium. "Dat is waar de D4-assay naartoe gaat."

En het project vordert. Eerder in het jaar, de onderzoekers gebruikten voorlopige resultaten van dit onderzoek om een ​​vijfjarige, $ 3,4 miljoen R01 onderzoeksprijs van het National Heart, Long, en Bloedinstituut. De medewerkers zullen werken aan het optimaliseren van deze fluorescentieverbeteringen terwijl ze putten integreren, microfluïdische kanalen en andere goedkope oplossingen in een eenstaps diagnostisch apparaat dat al deze stappen automatisch kan doorlopen en kan worden gelezen door een gewone smartphonecamera in een goedkoop apparaat.

"Een van de grote uitdagingen bij point-of-care-tests is de mogelijkheid om resultaten uit te lezen, waarvoor meestal zeer dure detectoren nodig zijn, " zei Mikkelsen. "Dat is een belangrijke wegversperring voor het hebben van wegwerptests waarmee patiënten chronische ziekten thuis of voor gebruik in instellingen met weinig middelen kunnen controleren. We zien deze technologie niet alleen als een manier om dat knelpunt te omzeilen, maar ook als een manier om de nauwkeurigheid en drempelwaarde van deze diagnostische apparaten te verbeteren."