Wetenschappers hebben ketens van moleculen met een precieze volgorde en lengte ontworpen en gesynthetiseerd om 3D-DNA-nanostructuren efficiënt te beschermen tegen structurele afbraak onder een verscheidenheid aan biomedisch relevante omstandigheden. Ze toonden aan hoe deze "peptoid-gecoate DNA-origami" het potentieel hebben om te worden gebruikt voor het afleveren van geneesmiddelen en eiwitten tegen kanker, beeldvorming van biologische moleculen, en gericht op celoppervlakreceptoren die betrokken zijn bij kanker. Hun methode voor het ontwerpen van peptoïden om DNA-origami in fysiologische omgevingen te stabiliseren, wordt beschreven in een paper gepubliceerd in de Proceedings van de National Academy of Sciences de week van 9 maart.

Net als bij de Japanse kunst van het vouwen van papier, DNA-origami is het vouwen van lange, flexibele DNA-ketens in gewenste vormen op nanoschaal (miljardsten van een meter) door verschillende delen van de keten te "nieten" met de complementaire basenparen van korte DNA-strengen. Deze programmeerbare en nauwkeurig gecontroleerde architecturen op nanoschaal kunnen gunstig zijn voor veel biomedische toepassingen, inclusief de gerichte levering van medicijnen en genen aan gewenste weefsels of cellen, beeldvorming van biologische processen in het lichaam, en biosensing voor ziektedetectie of gezondheidsmonitoring. Echter, om dergelijke toepassingen mogelijk te maken, zijn oplossingen nodig voor het beschermen van DNA-origamistructuren in complexe biologische vloeistoffen en het mogelijk maken van nieuwe functies die niet inherent zijn aan DNA.

"Een van de beperkende factoren bij het toepassen van de structuur- en vormvoordelen van DNA-origami op nanogeneeskunde is dat, geplaatst in het menselijk lichaam, de DNA-nanostructuur zou gemakkelijk worden verteerd door enzymen of worden afgebroken als reactie op veranderingen in de samenstelling van de oplossing of het pH-niveau, " verklaarde eerste auteur Shih-Ting (Christine) Wang, een postdoc in de Soft and Bio Nanomaterials Group van het Center for Functional Nanomaterials (CFN) bij het Brookhaven National Laboratory van het Amerikaanse Department of Energy (DOE). "Bij dit onderzoek we synthetiseerden biocompatibele moleculen, peptoïden genaamd, met een goed gedefinieerde moleculaire sequentiesamenstelling en lengte. We hebben octaëdrische DNA-origami - die een hoge mechanische stabiliteit heeft en een grote open ruimte voor het vervoeren van vracht op nanoschaal, zoals kleine moleculen tegen kanker - met deze peptoïden gecoat. Onze demonstraties toonden aan dat de peptoïde coatings de DNA-origami efficiënt beschermden in verschillende fysiologische omstandigheden en de toevoeging van verschillende chemische functionaliteiten voor biomedische toepassingen ondersteunden."

Peptoïden lijken op peptiden, of korte ketens van aminozuren. Echter, in peptoïden, de zijketens (chemische groepen bevestigd aan de hoofdketen of ruggengraat van het molecuul) zijn gehecht aan stikstof in plaats van aan koolstof. Bovendien, peptoïden zijn flexibeler, vanwege het ontbreken van waterstofbruggen in de ruggengraat. Deze flexibiliteit kan worden gebruikt om te bepalen hoe de peptoïden binden aan de DNA-origami.

"Ons doel was om een ​​minimalistische coating te maken die de origami niet dikker zou maken, maar tegelijkertijd efficiënt genoeg zou zijn om bescherming te bieden, oplosbaarheid, en compatibiliteit met verschillende biofuncties, " zei corresponderende auteur Oleg Gang, leider van de CFN Soft and Bio Nanomaterials Group en hoogleraar chemische technologie en toegepaste fysica en materiaalwetenschappen aan Columbia Engineering. "Als de gecoate origami volumineus wordt, zijn vorm en hoe het interageert met en plaats biedt aan andere biomoleculen en origami zou worden beïnvloed, allerlei complicaties met zich meebrengt."

Wang en bende, bijgestaan ​​door een medewerker van Imperial College London, gebruikte faciliteiten van de Molecular Foundry (MF) van het Lawrence Berkeley National Laboratory om twee soorten peptoïde architecturen te synthetiseren voor de bescherming van DNA-origami:borsteltype en bloktype. Beide architecturen hebben een DNA-bindend domein (positief geladen deel dat bindt aan het negatief geladen DNA) en een in water oplosbaar domein (deel dat ervoor zorgt dat DNA wordt omgeven door watermoleculen, die nodig zijn voor stabilisatie). De borstelachtige architectuur wisselt af tussen deze twee domeinen, terwijl de architectuur van het bloktype ze clustert om verschillende "blokken" te vormen.

Om te bepalen welk type beter bescherming bood, de wetenschappers bestudeerden de binding tussen tweestrengs (duplex) DNA en peptoïden. Experimenten met fluorescerende kleurstof (die zich bindt aan het DNA) toonden aan dat een specifieke borstelachtige architectuur het meest efficiënt was in het stabiliseren van duplex-DNA gecoat met peptoïden bij hoge temperatuur. Een medewerker van de RMIT University in Australië simuleerde de DNA-peptoïde-interacties op moleculair niveau om te begrijpen waarom.

"Wij geloven dat de afwisselende structuur een evenwicht bereikt, doordat sommige stukjes in de groef van de DNA-dubbele-helixstructuur zitten om bescherming te verlenen, terwijl andere stukken uitsteken om gunstig met water om te gaan, " zei Wang. "Een optimale configuratie is het borsteltype met 12 DNA-bindende en 12 in water oplosbare groepen."

Geleid door deze onderzoeken, het team onderzocht de structurele stabiliteit van de met peptoïde gecoate DNA-origami in verschillende soorten fysiologisch relevante omstandigheden:in een oplossing met een lage concentratie positief geladen magnesium (Mg)-ionen, in een oplossing die een DNA-specifiek nuclease (type enzym) bevat, en geïncubeerd in celkweekmedia (die zowel nucleasen als Mg-ionen in lage concentratie bevatten). Typisch, een hoge Mg-ionconcentratie is vereist om DNA-origami te stabiliseren door de afstoting van DNA-DNA-negatieve ladingen te verminderen, maar fysiologische vloeistoffen bevatten veel lagere concentraties.

Voor hun onderzoeken ze gebruikten een combinatie van experimentele technieken:agarosegelelektroforese, een werkwijze voor het scheiden van DNA-fragmenten (of andere macromoleculen) op basis van hun lading en grootte; transmissie-elektronenmicroscopie beeldvorming en dynamische lichtverstrooiing bij de CFN; en real-time kleine-hoek röntgenverstrooiing bij de Life Science X-ray Scattering (LiX) bundellijn van Brookhaven's National Synchrotron Light Source II (NSLS-II). De resultaten gaven aan dat de structuur van de origami intact was gebleven nadat deze was gecoat met speciaal ontworpen peptoïden en in de verschillende fysiologische omstandigheden was geplaatst.

Naar aanleiding van deze experimenten, de wetenschappers voerden een reeks demonstraties uit in samenwerking met de Bertozzi Group aan de Stanford University om te onderzoeken hoe de met peptoïde gecoate origami zou kunnen worden gebruikt in biomedische toepassingen. Bijvoorbeeld, ze laadden het chemotherapie-medicijn doxorubicine in de gecoate origami. Doxorubicine is een van de meest toegediende geneesmiddelen aan patiënten met HER2-positieve borstkanker, waarbij een overexpressie van het HER2-eiwit (een receptor op borstcellen) ervoor zorgt dat cellen zich ongecontroleerd delen en groeien. Meer dan 48 uur, de gecoate origami gaf minder doxorubicine af dan zijn niet-gecoate tegenhanger, zoals gemeten door de intensiteit van de intrinsieke fluorescentie van het medicijn.

"Het uiteindelijke doel is om de afgiftesnelheid tijdens het medicijnafgifteproces te kunnen moduleren om biologische en toxische effecten te beheersen, ’ legde Wang uit.

In een tweede nanocargo-demonstratie ze onderzochten of eiwitten op een vergelijkbare manier konden worden afgeleverd. Ze kapselden een van koeien afgeleid eiwit (vastgemaakt aan fluorescerende moleculen voor visualisatie) in de gecoate origami in de aanwezigheid van het eiwitverterende enzym trypsine. De vertering van dit ingekapselde eiwit door trypsine werd verminderd en vertraagd door een combinatie van de DNA-origami zelf en de peptoïde coating.

In een laatste demonstratie ze functionaliseerden het oppervlak van de met peptoïde gecoate DNA-origami met trastuzumab. Beter bekend onder de merknaam Herceptin, trastuzumab is een antilichaam dat zich richt op HER2-receptoren. Na binding aan deze receptoren, trastuzumab blokkeert de kankercellen van het ontvangen van de chemische signalen die ze nodig hebben om te groeien. Ze bereikten de oppervlaktefunctionalisering door chemische groepen toe te voegen aan specifieke plaatsen op het trastuzumab-molecuul en in de peptoïde sequenties. Door middel van "klikchemie, " deze groepen reageren selectief om covalente bindingen te vormen (vergelijkbaar met het klikken van een veiligheidsgordel).

Bij vervolgexperimenten Wang is van plan het potentieel van combinatorische therapie te onderzoeken, waarin peptoïde-gecoate DNA-origami met doxorubicine en met een trastuzumab-gefunctionaliseerd oppervlak zich richt op HER2-positieve borstkankercellen.

Wang kreeg financiering via Brookhaven's Technology Maturation Program om deze technologie verder te ontwikkelen op basis van een pitch die ze ontwikkelde als deelnemer aan de tweede workshop over ondernemerschapstraining die in april 2019 werd georganiseerd door Brookhaven's Office of Technology Transfer. Brookhaven's Intellectual Property Legal Group diende onlangs een voorlopige octrooiaanvraag voor de peptoid-ontwerpmethodologie bij het US Patent and Trademark Office.

"We gaan nu naar de translationele fase, experimenten uitvoeren met cellen en mogelijk hele organismen, ' zei Bende.