Opkomende eencellige diagnostiek vertrouwt op het potentieel om bacteriën snel en efficiënt te isoleren uit complexe biologische matrices. In een recente studie die nu is gepubliceerd in Microsystemen en nano-engineering , Jung Y. Han en collega's van de interdisciplinaire faculteiten Werktuigbouwkunde, Chemical Biomolecular Engineering en Bioengineering in de VS hebben een apparaat ontwikkeld om intacte en levensvatbare bacteriën uit volbloed te isoleren met behulp van een microfluïdische, poreuze silica monoliet. Ze bereikten mechanische hemolyse en zorgden voor doorgang van intacte en levensvatbare bacteriën door de monolieten voor op grootte gebaseerde bacteriële isolatie en selectieve lysis. Han et al. beschreef een proces om grote hoeveelheden discrete capillairgebonden monolietelementen en millimeterschaal monolietstenen te synthetiseren om te integreren in microfluïdische chips.

Ze onderzochten de impact van monolithische morfologie, geometrie en stroomomstandigheden op cellysis en stroomregimes die selectieve cellysis en selectieve passage van meerdere gram-negatieve en gram-positieve bacteriën mogelijk maakten. De techniek van Han et al. maakte snelle monstervoorbereiding en bacteriële analyse mogelijk in combinatie met eencellige Raman-spectrometrie. Het werk biedt unieke monstervoorbereidingsstappen ter ondersteuning van snelle en kweekvrije bacteriële analyse voor toepassingen in point-of-care biomedische apparaten.

Bacteriën in het bloed kunnen leiden tot sepsis, infectie van weefsels en andere ernstige medische aandoeningen, die vroege identificatie van bloedoverdraagbare bacteriën vereisen voor een effectieve behandeling. Het vermogen om bacteriën snel te identificeren met behulp van point-of-care-diagnostiek kan het klinische potentieel voor een optimale behandeling tijdens infectie in een vroeg stadium aanzienlijk vergroten. De bestaande gouden standaard voor bacteriële karakterisering is gebaseerd op fenotypische celcultuuranalyse en vereist ten minste 24 uur om monsters te verzamelen voor kweek en analyse in een diagnostisch en klinisch microbiologisch laboratorium. De bestaande techniek is robuust en goedkoop, maar kan geen tijdige resultaten opleveren om de beginfasen van de behandeling te begeleiden.

In het huidige werk, Han et al. verkende microfluïdische apparaten geïntegreerd met poreuze silica-monolieten als eenvoudige doorstroomelementen voor selectieve bloedcelanalyse en de intacte isolatie van bacteriën. Monolieten zijn zeer poreuze materialen die zijn samengesteld uit open celmorfologie met kronkelende paden van vloeistofstroom. Wetenschappers kunnen monolithische poriemorfologie beheersen via hoge mechanische oppervlaktespanning tijdens celperfusie voor mechanische hemolyse van bloedcellen, terwijl intacte en levensvatbare bacteriën de kronkelende stroompaden kunnen afleggen voor hun cultuurvrije isolatie. Han et al. gebruikte de benadering van selectieve passage voor bacteriën in volbloed onder stroomomstandigheden voor gram-positieve en gram-negatieve soorten, ondanks verschillen van de bacteriestammen. De techniek van selectieve monolietlysis met hoge doorvoer in combinatie met krachtige analytische methoden zoals Raman-spectroscopie kan een cultuurvrije analyse van bacteriën in volbloed op het niveau van de enkele cel mogelijk maken.

Han et al. gemodificeerde eerder gerapporteerde siliciummonolietsyntheseprocessen, gevolgd door hydrolyse en condensatie van silica tot silicaglas bij lage temperaturen. Om de silicamonoliet te bereiden, de wetenschappers gebruikten een voorloperoplossing bestaande uit alkylsilicaten, polyethyleenglycol (PEG) als porogeen, ureum als bron van hydroxylionen om heterogeniteit en azijnzuur te minimaliseren. Toen ze het synthetische proces optimaliseerden, de resulterende monolieten waren homogeen en goed verankerd aan de capillaire wanden van silica. De wetenschappers maten de dikte van de uiteindelijke monolietstructuur van het skelet en berekenden de permeabiliteit ervan met behulp van hoogwaardige vloeistofchromatografie om experimentele omstandigheden te beheersen. Om intrinsieke variatie te minimaliseren, Han et al. snijd de resulterende capillaire buisjes in segmenten van 5 cm lang om de permeabiliteit voor gebruik te testen.

Vervolgens ontwikkelden ze twee complementaire methoden voor lage en hoge doorvoer om silicamonolieten te integreren in microfluïdische systemen. Om een ​​lage doorvoer mogelijk te maken, de wetenschappers hebben monolietbevattende capillaire segmenten ingebed in thermoplastische microfluïdische chips om de monoliet tijdens integratie te beschermen. Voor selectieve lysis met hoge doorvoer gebruikten ze monolieten met grotere dwarsdoorsnede-oppervlakken binnen de microfluïdische apparaten. De complete fabricagemethode leverde een uitstekende betrouwbaarheid op voor een lekvrije werking tijdens volbloedperfusie.

Als proof-of-principle, Han et al. geselecteerde Enterobacter cloacae (gram-negatief, staafvormige bacteriën) om hun doeltreffendheid van passage te onderzoeken, naast drie gram-positieve bacteriën; Lactococcus lactis, Micrococcus luteus en Bacillus subtilis. Tijdens de experimenten, ze perfuseerden bacteriële oplossingen door de microfluïdische monolieten met verschillende geometrie en stroomomstandigheden om de passage van bacteriën en de lysis van bloedcellen te testen met behulp van dynamische lichtverstrooiing (DLS). Bijvoorbeeld, de perfusie van gezuiverde E. cloacae door de monoliet leverde geen waarneembare veranderingen in de DLS-pieken op, wijst op de intacte passage van bacteriën.

De wetenschappers toonden het effect van de lengte van het poreuze monolietapparaat op de efficiëntie van de lysis van rode bloedcellen (RBC). De resultaten gaven aan dat de RBC-lysis-efficiëntie significant toenam voor monolietlengtes boven 1 mm. Han et al. bestudeerde ook het lot van witte bloedcellen (WBC's) tijdens de werking van het monolietapparaat, de cellen konden niet door de monoliet gaan zonder te worden gelyseerd, vergelijkbaar met RBC's. Technisch gezien, RBC's vervormd tot een schijfvorm om door de monoliet te gaan, wat een significant verhoogde membraanspanning veroorzaakte om te resulteren in RBC-lysis. Ter vergelijking, bacteriële cellen hadden vergelijkbare afmetingen als de monolietporiën en hadden daarom minder celwandexpansie nodig voor een succesvolle passage zonder breuk. De wetenschappers optimaliseerden de parameters van het apparaat zodat verschillende bacteriën hoge niveaus van membraanstress kunnen verdragen zonder te scheuren. Verdere ontwikkelingen zorgden voor een intacte passage van bacteriën zonder afbraak en met levensvatbaarheid.

Voor bacteriële passage met hoge doorvoer, de wetenschappers verdunnen het bloed in de capillaire apparaten. Echter, als een alternatief, ze zouden ook de capaciteit van monolieten voor de lysis van volbloed kunnen vergroten. De apparaten verwerkten meer dan 400 µL volbloed verrijkt met bacteriën voordat ze een significante toename van de tegendruk vertoonden, door verstopping als gevolg van cellysis en ook door intacte leukocyten (WBC's) die in de poreuze matrix zijn opgesloten.

Om doelbacteriën te lokaliseren, Han et al. verkregen een monster afgezet op een glasplaatje, nadat het door het monoliet-proces is gegaan. Ze voerden eencellige Raman-analyse uit door de optische sonde handmatig over het monster te scannen. Ze verwachten het gebruik van selectieve lysistechnologie, gekoppeld aan confocale Raman-microscopie in de toekomst om het proces van het detecteren van bacteriële stammen van belang bij lage concentraties op een gedefinieerde locatie van belang te verbeteren.

Op deze manier, Jung Y. Han en collega's ontwikkelden een microfluïdische monoliet om intacte bacteriën efficiënt te isoleren met uitgebreide theranostische, point-of-care potentieel voor klinische toepassingen. Ze stellen zich de vereniging voor van confocale Raman-microscopiehulpmiddelen die momenteel grotendeels beperkt zijn tot het onderzoekslaboratorium met opkomende geminiaturiseerde en draagbare systemen om de weg vrij te maken voor snelle en draagbare point-of-care-apparaten.

© 2019 Wetenschap X Netwerk