Het inbrengen of tweaken van genen in planten is meer kunst dan wetenschap, maar een nieuwe techniek ontwikkeld door de Universiteit van Californië, Berkeley, wetenschappers zouden elk type plant genetisch kunnen manipuleren, in het bijzonder genbewerking met CRISPR-Cas9—eenvoudig en snel.

Om een ​​gen af ​​te leveren, de onderzoekers enten het op een koolstofnanobuisje, die klein genoeg is om gemakkelijk door de taaie celwand van een plant te glippen. Daten, de meeste genetische manipulatie van planten wordt gedaan door genen in het weefsel af te vuren - een proces dat bekend staat als biolistiek - of door genen af ​​​​te leveren via bacteriën. Beide zijn slechts een klein percentage van de tijd succesvol, dat is een grote beperking voor wetenschappers die ziekte- of droogteresistente gewassen willen creëren of planten willen manipuleren zodat ze gemakkelijker kunnen worden omgezet in biobrandstoffen.

nanobuisjes, echter, zijn zeer succesvol in het afleveren van een gen in de kern en ook in de chloroplast, een structuur in de cel die met de huidige methoden nog moeilijker te targeten is. Chloroplasten, die hun eigen aparte hebben, hoewel klein, genoom, licht absorberen en de energie opslaan voor toekomstig gebruik, daarbij zuurstof vrijgeven. Een eenvoudige techniek voor het afleveren van genen zou een zegen zijn voor wetenschappers die nu proberen de efficiëntie van het opvangen van lichtenergie te verbeteren om de gewasopbrengst te verhogen.

De nanobuis beschermt niet alleen het DNA tegen afbraak door de cel, maar voorkomt ook dat het in het genoom van de plant wordt ingebracht. Als resultaat, de techniek maakt genetische modificaties of verwijderingen mogelijk die in de Verenigde Staten en andere landen dan de Europese Unie niet leiden tot de aanduiding "genetisch gemodificeerd, " of GGO's.

"Een van de voordelen is alleen de tijdwinst met een technologie als deze, " zei Markita Landry, een UC Berkeley assistent-professor chemische en biomoleculaire engineering. "Maar ik denk dat de belangrijkste vooruitgang het vermogen zal zijn om snel en efficiënt genen aan planten over soorten heen te leveren en op een manier die het genereren van transgene plantenlijnen mogelijk maakt zonder integratie van vreemd DNA in het plantengenoom."

Een belangrijk gebruik zou CRISPR-Cas9-genbewerking zijn:het leveren van het gen voor Cas9, dat is het enzym dat zich richt op en DNA snijdt, samen met de DNA-coderingsgids RNA - het adreslabel van Cas9 - om specifieke genen met hoge precisie te bewerken. En DNA gebonden aan een nanobuisje is zeer winterhard.

"We hebben de stabiliteit van de constructies en de kosten beoordeeld en, op beide punten, dit is vatbaar voor garagewetenschap, ' zei Landry. 'Je kunt deze dingen in een envelop stoppen en ze zo ongeveer overal naar toe sturen. Je hebt geen koelkast nodig, een genenkanon, bacteriën; je hebt niet veel nodig om ermee te werken, en ze zijn maandenlang stabiel. We kunnen ze op schaal genereren, bevries ze, ontdooi ze - het zijn stevige kleine dingen."

Landry en haar collega's zullen hun resultaten op 25 februari online rapporteren voorafgaand aan publicatie in het tijdschrift Natuur Nanotechnologie .

CRISPR-bezorging

Landry ontdekte dat nanobuisjes gemakkelijk door plantencelwanden glippen, die bekend staan ​​om hun taaie lagen, terwijl ze cellen proberen te labelen met nanobuissensoren. De sensoren kwamen in de cel terecht, niet op het celoppervlak.

Ze zag meteen hoe ze dit kon omdraaien om genen in planten af ​​te leveren. De huidige methoden zijn omslachtig en kunnen een laag rendement opleveren. Het gebruik van genenpistolen is destructief; het is alsof je een gat in een plantencel blaast en hoopt dat je gen en de cel allebei overleven. Niet alle planten kunnen worden geïnfecteerd door gendragende Agrobacterium, en een andere techniek, pathogene virussen gebruiken om genen te dragen, werkt voor een nog kleiner aantal planten en riskeert het inbrengen van viraal DNA in het genoom van de plant. Ze moeten allemaal worden aangepast voor elke plant, en het aangeleverde DNA wordt geïntegreerd in het genoom:de definitie van ggo.

Zin om het eens te proberen, Landry en haar collega's wikkelden het gen voor groen fluorescerend eiwit (GFP) rond een nanobuis en injecteerden het in een biologisch rucolablad dat was gekocht bij een lokale Whole Foods Market. Binnen een dag, de plantencellen gloeiden groen onder UV-licht, wat aangeeft dat het GFP-gen was getranscribeerd en vertaald in eiwit, alsof het het eigen gen van de plant is.

Het effect hield maar een paar dagen aan, echter, waarschijnlijk omdat de eiwitten worden gerecycled, en het DNA wordt langzaam afgebroken.

Een korte levensduur is geen nadeel, echter.

"Een deel van wat het platform uniek maakt, is dat de uitdrukking van voorbijgaande aard is. Als we zeven tot tien dagen later in de microscoop kijken, de uitdrukking is weg, de fluorescentie is weg. Dat is niet het geval bij Agrobacterium, " zei Landry. Voor wetenschappers die bestuderen hoe planten werken, een gen voor een korte tijd tot expressie brengen, kan hen veel vertellen over de rol van het gen in de cel.

"Om dit een breed bruikbaar platform te laten zijn, echter, we moeten een eiwit tot expressie brengen dat op zichzelf een permanent effect heeft op het nucleaire genoom, " voegde ze eraan toe.

Haar plan is om DNA te verpakken in een enkelstrengs plasmide dat vervolgens wordt vastgemaakt aan een koolstofnanobuisje. Binnen twee of drie dagen na verspreiding in de cel, zowel het Cas9-eiwit als het CRISPR-gids-RNA zouden worden uitgedrukt, waardoor ze zich kunnen verbinden om een ​​ribonucleoproteïnecomplex te vormen dat het genoom bewerkt, permanent. Ze heeft geen toxische effecten van het nanobuisje gevonden.

"Dus, nu heb je een plant die is bewerkt, maar dat zou buiten Europa als niet-GGO worden beschouwd, " ze zei.

De nanobuis opladen

Zij en haar collega's testten de levering van nanobuisjes in andere planten:tabak, een werkpaard van plantengenetica; katoen, waarvan het genoom notoir moeilijk te kraken is; en tarwe. Genetisch gemanipuleerde versies van deze planten zijn al op de markt, maar een vereenvoudigde techniek zou de introductie van nieuwe en voordelige genen kunnen versnellen. Tabak, bijvoorbeeld, is ontwikkeld om geneesmiddelen zoals geneesmiddelen tegen kanker te produceren.

Hoewel Landry en haar collega's nog niet volledig begrijpen hoe de levering van nanobuisjes werkt, de gemakkelijke invoer van nanobuisjes is geen totale verrassing, ze zei. De celwanden van planten laten dingen gemakkelijk naar binnen glippen als ze kleiner zijn dan ongeveer 5 tot 20 nanometer, wat veel minder is dan de limiet van 500 nanometer van zoogdiercellen. De nanobuisjes hebben een diameter van ongeveer 1 nanometer, al zijn ze zo'n 300 nanometer lang:genoeg ruimte om tientallen genen aan te sluiten. Plantencellen zijn in de orde van 10, 000 nanometer breed.

Zij en haar laboratoriumcollega's probeerden verschillende technieken uit om DNA aan nanobuisjes te hechten en ontdekten dat de strakste binding het beste werkte. Toen de onderzoekers de nanobuis een positieve lading gaven voordat ze het DNA introduceerden, het plakte als papier aan een kam die was geladen met statische elektriciteit.

Ze voert nu experimenten uit met DNA-origami-nanodeeltjes om beter te begrijpen wat er in de plantencellen gebeurt nadat de nanobuis en het DNA zijn binnengekomen, en experimenteert met de levering van nanobuisjes aan planten van andere soorten moleculen, specifiek RNA en eiwitten.

"Het verbazingwekkende van deze koolstofnanobuisjes is dat ze voorbij de celwand kunnen komen en de kern of de chloroplasten kunnen binnengaan. Het is een nieuwe vooruitgang die ons in staat stelt om echt de tools in te voeren voor genoombewerking, " zei Brian Staskawicz, hoogleraar planten- en microbiële biologie en wetenschappelijk directeur landbouw van het Innovative Genomics Institute, die verdere werkzaamheden aan CRISPR-levering door Landry en haar team financiert. "De volgende stappen zouden zijn, kunnen we ribonucleïne-eiwitten afleveren of kunnen we mRNA of DNA afleveren dat eigenlijk zou coderen voor CRISPR-Cas9?"