Soms bieden ouderwetse methoden de beste manieren om geavanceerde technologie en de effecten ervan op de moderne wereld te bestuderen.

Een 65 jaar oude laboratoriumtechniek een nieuwe rol geven, onderzoekers van het National Institute of Standards and Technology (NIST) hebben de schoonste scheiding tot nu toe uitgevoerd van synthetische nanodeeltjes van een levend organisme. De nieuwe NIST-methode zal naar verwachting de experimenten aanzienlijk verbeteren, waarbij wordt gekeken naar de mogelijke milieu- en gezondheidseffecten van deze vervaardigde entiteiten. Het zal wetenschappers in staat stellen om nauwkeuriger te tellen hoeveel nanodeeltjes daadwerkelijk zijn opgenomen door organismen die eraan zijn blootgesteld.

Een paper waarin de nieuwe methode wordt beschreven, verschijnt in het huidige nummer van het tijdschrift ACS Nano .

De gewone rondworm Caenorhabditis elegans is de afgelopen jaren gebruikt als een levend model voor laboratoriumonderzoek naar de invloed van biologische en chemische verbindingen op meercellige organismen. Deze verbindingen omvatten gemanipuleerde nanodeeltjes (ENP's), stukjes materiaal tussen 1 en 100 nanometer (miljardste van een meter, of ongeveer 1/10, 000 de diameter van een rode bloedcel). Eerder onderzoek was vaak gericht op het kwantificeren van de hoeveelheid en grootte van gemanipuleerde nanodeeltjes die door C. elegans worden ingenomen. Het meten van de nanodeeltjes die daadwerkelijk in een organisme terechtkomen, wordt beschouwd als een relevantere indicator van potentiële toxiciteit dan alleen de hoeveelheid ENP's waaraan de wormen worden blootgesteld.

Traditionele methoden voor het tellen van ingenomen ENP's hebben twijfelachtige resultaten opgeleverd. Momenteel, onderzoekers stellen C. elegans bloot aan metalen ENP's zoals zilver of goud in oplossing, spoel vervolgens de overtollige deeltjes weg met water, gevolgd door centrifugeren en vriesdrogen. Een deel van het geproduceerde "gereinigde" monster wordt dan typisch onderzocht met een techniek die de aanwezige hoeveelheid metaal bepaalt, bekend als inductief gekoppelde plasma-massaspectrometrie (ICP-MS). Het levert vaak ENP-tellingen op in de tienduizenden per worm; echter, die aantallen lijken altijd te hoog voor NIST-onderzoekers die met C. elegans werken.

"Aangezien ICP-MS alle nanodeeltjes zal detecteren die bij de wormen horen, zowel degenen die worden ingenomen als degenen die extern blijven vastzitten, we vermoeden dat dit laatste het aantal 'ENP's' per worm zo hoog maakt, " zei NIST analytisch chemicus Monique Johnson, de hoofdauteur van het ACS Nano-papier. "Omdat we alleen de ingenomen ENP's wilden kwantificeren, er was behoefte aan een robuustere en betrouwbaardere scheidingsmethode."

Gelukkig, de oplossing voor het probleem lag al in het lab.

Tijdens het kweken van C. elegans voor ENP-exposure-experimenten, Johnson en haar collega's hadden sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie gebruikt, een decennia oud en gevestigd systeem voor het netjes scheiden van celcomponenten, om de wormen te isoleren van puin en bacteriën. "We vroegen ons af of hetzelfde proces ons ook in staat zou stellen om een ​​organisme-van-ENP-scheiding uit te voeren, dus ontwierp ik een studie om erachter te komen, ' zei Johnson.

In hun experiment hebben de NIST-onderzoekers stelden eerst afzonderlijke monsters van C. elegans bloot aan lage en hoge concentraties van gouden nanobolletjes van twee groottes, 30 en 60 nanometer in diameter. De onderzoekers stopten elk van de monsters in een centrifuge en verwijderden het supernatant (vloeibare gedeelte), de wormen en ENP's in de resterende pellets achterlaten. Deze werden twee keer gecentrifugeerd in een zoutoplossing (in plaats van alleen water zoals bij eerdere scheidingsmethoden), en dan weer gecentrifugeerd, maar deze keer, door een uniek ontworpen sucrosedichtheidsgradiënt.

"Van boven naar beneden, onze gradiënt bestond uit een zoutoplossingslaag om overtollige ENP's op te vangen en drie steeds dichtere lagen sucrose [20, 40 en 50 procent] om de C. elegans te isoleren, Johnson legde uit. "We volgden de gradiënt met drie waterspoelingen en centrifugeren om ervoor te zorgen dat alleen wormen met ingeslikte ENP's, en niet het sucrose-scheidingsmedium met overtollige ENP's, zou maken in de laatste pellet."

Analyse van het bereik van massa's in de ultragezuiverde monsters gaf aan dat goudniveaus meer in overeenstemming waren met wat de onderzoekers verwachtten als ingenomen ENP's. Experimentele validatie van het succes van de NIST-scheidingsmethode kwam toen de wormen in detail werden onderzocht onder een scanning elektronenmicroscoop (SEM).

"Voor mij, het eureka-moment was toen ik voor het eerst gouden ENP's zag in de dwarsdoorsnedebeelden van de C. elegans-monsters die waren verwerkt door de sucrosedichtheidsgradiënt, "Zei Johnson. "Ik had gedroomd over het vinden van ENP's in het spijsverteringskanaal van de worm en nu waren ze er echt!"

De SEM-afbeeldingen met hoge resolutie leverden ook visueel bewijs dat alleen ingenomen ENP's werden geteld. "Er waren geen ENP's vastgemaakt aan de cuticula, het exoskelet van C. elegans, in elk van de sucrosedichtheidsgradiëntmonsters, Johnson zei. "Toen we wormen onderzochten uit onze controle-experimenten [verwerkt met de traditionele niet-gradiënt, scheidingsmethode met alleen waterspoeling], er werden een aantal nanosferen gevonden die aan de cuticula waren vastgemaakt.

Nu het met succes is aangetoond, de NIST-onderzoekers zijn van plan hun systeem voor het evalueren van de opname van ENP's door C. elegans te verfijnen en verder te valideren. "Hopelijk, onze methode zal een nuttig en waardevol hulpmiddel worden voor het verminderen van de meetvariabiliteit en bemonsteringsbias die milieu-nanotoxicologische studies kunnen teisteren, ' zei Johnson.