(PhysOrg.com) -- Als Gang Ren de besturing van zijn cryo-elektronenmicroscoop laat draaien, hij vergelijkt het met het finetunen van de versnellingen en remmen van een racefiets. Maar deze machine in het Lawrence Berkeley National Laboratory (Berkeley Lab) van het Amerikaanse Department of Energy (DOE) is iets complexer. Het kost bijna $ 1,5 miljoen, werkt bij de koude temperatuur van vloeibare stikstof, en het stelt wetenschappers in staat te zien wat niemand eerder heeft gezien.

Bij de Moleculaire Gieterij, Berkeley Lab's veelgeprezen onderzoekscentrum voor nanotechnologie, Ren heeft zijn Zeiss Libra 120 Cryo-Tem-microscoop naar resoluties geduwd die de Duitse fabrikanten nooit hadden voorzien, het produceren van gedetailleerde snapshots van individuele moleculen. Vandaag, hij en zijn collega Lei Zhang rapporteren de eerste 3D-beelden van een individueel eiwit dat ooit is verkregen met voldoende duidelijkheid om de structuur ervan te bepalen.

Wetenschappers maken routinematig modellen van eiwitten met behulp van röntgendiffractie, nucleaire magnetische resonantie, en conventionele cryo-elektronenmicroscoop (cryoEM) beeldvorming. Maar deze modellen vereisen computer "middeling" van gegevens uit analyse van duizenden, of zelfs miljoenen soortgelijke moleculen, omdat het zo moeilijk is om de kenmerken van een enkel deeltje op te lossen. Ren en Zhang hebben precies dat gedaan, het genereren van gedetailleerde modellen met behulp van elektronenmicroscopische afbeeldingen van een enkel eiwit.

Hij noemt zijn techniek “individuele-deeltjeselektronentomografie, ” of IPET. Het werk wordt beschreven in het nummer van 24 januari van: PLoS One , het open source wetenschappelijke tijdschrift, in een artikel getiteld "IPET and FETR:Experimental Approach for Studying Molecular Structure Dynamics by Cryo-Electron Tomography of a Single-Molecule Structure."

De 3D-beelden die in het artikel worden vermeld, omvatten die van een enkel IgG-antilichaam en apolipoproteïne A-1 (ApoA-1), een eiwit dat betrokken is bij de menselijke stofwisseling. Het doel van Ren is om individuele 3D-beelden te maken van medisch belangrijke eiwitten, zoals HDL - het hartbeschermende 'goede cholesterol' waarvan de structuur de inspanningen van legioenen wetenschappers die met veel krachtigere eiwitmodelleringstools zijn bewapend, heeft ontweken. “We zijn goed op weg, ’ zegt Rens.

Ren heeft de geloofsbrieven van iemand die weet wat hij kan. Hij werd in augustus 2010 aangeworven om bij Berkeley Lab te werken aan de Universiteit van Californië in San Francisco, waar hij een cryo-elektronenmicroscoop en meer conventionele middelingstechnieken had gebruikt om de 3D-structuur van LDL te onderscheiden - het "slechte cholesterol" waarvan men dacht dat het een belangrijke risicofactor voor hartaandoeningen was.

Zijn beelden van afzonderlijke eiwitten zijn een beetje wazig, zelfs nadat ze zijn opgeschoond door complexe computerfiltering, maar zeer informatief voor de getrainde waarnemer. Deze individuele deeltjes zijn buitengewoon klein, waarbij Ren op nul moet worden gezet op een plek van minder dan 20 nanometer. Hij heeft eiwitbeelden gerapporteerd zo klein als 70 kDa. Dat is kilodalton, een lilliputterschaal (uitgedrukt in massa-eenheden) gereserveerd voor het meten van atomen, moleculen, en stukjes DNA. Het is een handigere manier om zachte objecten zoals eiwitten die kunnen worden samengeklonterd, op maat te maken. vezelig, of floppy.

In tegenstelling tot de sculpturale afbeeldingen van eiwitmodellen, een reeks van deze foto's kan een idee geven van deze deeltjes in al hun floppines op nanoschaal. Binnen de complexe structuur van deze eiwitten liggen de geheimen van hun functie, en misschien sleutels tot medicijnen die de slechte blokkeren en de goede promoten. Met wat extra computerfiltering, uit de afbeeldingen kan een contrastrijk eiwitmodel worden gegenereerd en geanimeerd om de bewegende delen in 3D weer te geven.

“Hierdoor kun je de persoonlijkheid van elk eiwit zien, ’, zegt Rens. "Het is een proof of concept voor iets waarvan mensen dachten dat het onmogelijk was."

Door de structuur van afzonderlijke eiwitten te observeren, het is mogelijk om hun flexibele, Bewegende onderdelen. "Dit opent een deur voor de studie van eiwitdynamica, ', zegt Ren. “Antilichamen, bijvoorbeeld, zijn niet solide. Ze zijn erg flexibel, heel dynamisch.”

Hoe haalde Ren zoveel veelzijdigheid uit zijn Libra 120? “Het is niet een heel high-end model, ’ geeft hij toe. Veel heeft te maken met de accessoires die hij aan de machine vastschroeft, en met zijn eigen kunstenaarschap en geduld. Hij heeft de microscoop uitgerust met een $ 300, 000 CCD-camera, een aantal krachtige beeldverwerkingssoftware, speciale contrastmiddelen, en een apparaat dat een "energiefilter" wordt genoemd en dat de gedigitaliseerde cameragegevens doorzoekt en zwakke signalen opruimt. Grondig vertrouwd met zijn op maat gemaakte machine, hij gebruikt ook een element van elleboogvet, lange dagen werken om de krachtige beelden uit een stortvloed van digitale ruis te halen.

De meerdere hoeken die worden gebruikt om het 3D-portret te maken, helpen bij het oplossen van het vage moleculaire beeld. “Alle beelden zijn luidruchtig, ’ legt Ren uit. “In de natuurkunde de ruis is inconsistent tussen de afbeeldingen, maar het signaal - het object of eiwit - is consistent. Door deze aanpak te gebruiken, we vinden dat het consistente deel (het signaal) kan worden verbeterd, terwijl het inconsistente deel (de ruis) aanzienlijk zal worden verminderd.

Elektronenmicroscopen concentreren elektronenstromen in plaats van licht om ongelooflijk kleine dingen te zien. De korte golflengte van een elektronenbundel maakt een veel hogere resolutie en vergroting mogelijk dan zichtbaar licht. Krachtige elektronenmicroscopen worden al tientallen jaren gebruikt om materialen op atomaire schaal te onderzoeken; en pal naast de Molecular Foundry is Berkeley Lab's National Center for Electron Microscopy, die de krachtigste microscopen ter wereld herbergt. De TEAM 0.5-microscoop kan objecten zo klein als de straal van een waterstofatoom onderscheiden. Maar deze zwaargewicht microscopen halen deze resolutie op atomaire schaal met energiepulsen die de meeste zachte biologische eiwitten zouden vernietigen. De krachtige elektronenmicroscopen worden voornamelijk gebruikt voor het onderzoeken van atomaire structuren van sterke, vaste materialen, zoals grafeen - een rooster van koolstof van slechts één atoom dik.

Ren's lab is gespecialiseerd in cryoEM, die objecten onderzoekt die zijn bevroren bij -180 ° C (-292 ° F). Een bad van vloeibare stikstof bevriest monsters zo snel dat er geen ijskristallen ontstaan. “Het is amorf, zoals glas, ’ zegt Rens. De eiwitmonsters worden ingevroren op een schijf ter grootte van de vingernagel van een baby, gevuld met kleine putjes van 2 micron breed. De schijf wordt in de microscoop gestoken op een roterende steun die het monster tot 140° kan kantelen in een vacuüm - voldoende camerahoeken om een ​​3D-perspectief te produceren. “De uitdaging is om het te isoleren van de lucht, en om het te draaien zonder trillingen, zelfs de trillingen van het borrelen van vloeibare stikstof, ’, zegt Rens.

De extreem lage temperatuur fixeert de monsters en voorkomt dat ze uitdrogen in het vacuüm dat nodig is voor de elektronenscan. Het schept gunstige omstandigheden voor beeldvorming bij veel lagere doses elektronen - laag genoeg om een ​​enkel zacht eiwit intact te houden, terwijl er meer dan 100 beelden worden gemaakt over een periode van één tot twee uur.