Het humaan immunodeficiëntievirus, of hiv, voert oorlog in ons lichaam met behulp van een strategie die in de loop van miljoenen jaren is ontwikkeld en die onze eigen cellulaire machines tegen zichzelf keert. Ondanks enorme vooruitgang in het begrijpen van de ziekte, er zijn nog belangrijke hiaten. Voor jaren, wetenschappers van de Universiteit van Utah wilden dat er een manier was om te visualiseren hoe het virus en zijn moleculen in realtime interageren met menselijke cellen. Dus, een onderzoeksgroep ontwikkelde er een.

De nieuwe methode maakt gebruik van interferometrie om visualisaties met extreem hoge resolutie vast te leggen van miljoenen moleculen die door viskeuze gels of een plasmamembraan bewegen. Ipsita Saha, promovendus natuurkunde en hoofdauteur van de studie, ontwikkelde een correlatieanalyse die theoretisch uitlegde hoe de interferometriemicroscoop onderscheid kon maken tussen twee soorten beweging - stroming en diffusie - en zij en senior auteur Saveez Saffarian hebben dit experimenteel geverifieerd. De methode brengt ons een stap dichter bij het visualiseren van de interactie van moleculen in een echte levende cel.

"Er zijn al methoden die vastleggen hoe moleculen stromen en diffunderen in twee dimensies. We wilden zien wat er gebeurt in de hele cellulaire omgeving. Hoe werken deze moleculen? Wat voor soort interacties vinden er plaats?" zei Saha, die ook verbonden is aan het Center for Cell and Genome Science (CCGS) aan de U.

"Tot dusver, we zijn overgelaten om ons deze interacties alleen maar voor te stellen. We hebben zeer beperkte manieren om daadwerkelijk de cel in te gaan en te observeren hoe al deze moleculen tegelijkertijd samen dansen, " zei senior auteur Saffarian, universitair hoofddocent natuurkunde, adjunct-assistent-professor biologie en aangesloten bij de CCGS. "We moesten echt methoden met een hogere resolutie genereren die naar de dynamiek van biologische moleculen kunnen kijken."

De studie gepubliceerd in het tijdschrift PLOS EEN op 18 december, 2019.

Stroom en diffusie

Cellen functioneren als een efficiënt kantoor. Eiwitten en andere moleculen voeren taken uit, producten ontwikkelen, met elkaar communiceren en bewegen, zelfs hun specifieke cel verlaten om de wijde wereld in te waden. Beweging is cruciaal voor moleculen om elkaar en hun omgeving te vinden en ermee om te gaan. Deze studie had tot doel onderscheid te maken tussen twee soorten bewegingen:stroming en diffusie.

Moleculen stromen wanneer ze een neiging hebben om in een bepaalde richting te bewegen. Diffusie is wanneer moleculen willekeurig bewegen. Om te begrijpen hoe cellen of virussen werken, het is belangrijk om de mechanica van hoe ze bewegen te begrijpen.

"Bedragen deze moleculen verschillende dingen van de ene plaats naar de andere, of zijn er andere processen gaande?" zei Saha. "Deze methode kan specifiek onderscheid maken tussen stroming en diffusie in drie dimensies."

De onderzoekers gebruikten een interferometriemicroscoop, die de afstand meet die licht over nanoschalen aflegt. Moleculen zenden fotonen uit die reizen als lichtgolven, elk met specifieke amplitudes en frequenties. Voor het experiment, de microscoop splitste een lichtstraal in twee stralen die langs verschillende paden gingen, uiteindelijk terugkomen om elkaar te ontmoeten. Deze bundels combineren in een prisma, en drie afzonderlijke reflecties van hun combinatie worden afgebeeld op drie camera's. De interferentie is zodanig dat als een molecuul 80 nanometer beweegt, het beeld wordt verschoven naar een andere camera. Dit is een extreem hoge resolutie - een menselijke rode bloedcel is ongeveer 7, 000 nanometer breed. De onderzoekers maten de resolutie in voxels, die pixels in drie dimensies zijn.

Saha en Saffarian creëerden een sucrosegel die werd geïnjecteerd met kwantumstippen - door de mens gemaakte kristallen op nanoschaal die elektronen geleiden. De quantum dots produceren een signaal dat de microscoop kan detecteren. Door eerst te leren hoe kwantumstippen in de gel bewegen, de wetenschappers valideerden hun techniek, die vervolgens kunnen worden toegepast op hoe eiwitten zich in een cel verplaatsen. Ze koelden de gel af tot kamertemperatuur om de substantie te vertragen tot een snelheid die de camera's konden vastleggen.

"Je kunt echt zien of moleculen in een bepaalde richting gaan of dat ze willekeurig bewegen. En je kunt dit doen in heel, zeer kleine voxels over een grote dwarsdoorsnede van het monster, die een enorme schat aan informatie heeft, " zei Saffarian. De wetenschappers gebruikten het Center for High Performance Computing aan de U om de enorme hoeveelheden gegevens te verwerken.

De onderzoekers maten hoe lang deze lichtgolven elkaar "herinnerden" door te berekenen hoe lang de golven hun amplitude en frequentie zouden behouden. coherentie genoemd. Licht dat door hetzelfde molecuul wordt uitgezonden, zal met dezelfde samenhang in de camera's verschijnen. Ze gebruikten de correlatiefunctie om erachter te komen hoe de moleculen bewogen en in welke richting. Als de gesplitste lichtbundels op afzonderlijke paden lopen die minder dan 10 micron van elkaar verwijderd zijn, ze herinneren zich dat ze uit hetzelfde molecuul kwamen. Als de lichtstralen elkaar weer ontmoeten, ze zullen recombineren met die kennis. Als ze niets van elkaar weten, ze hebben een kans van 30% om in een van de drie camera's te verschijnen. Als ze elkaar nog herinneren, ze hebben 100% kans om in één camera te verschijnen, maar een kans van 0% om in de anderen te verschijnen. Deze methode meet het licht dat wordt uitgezonden door miljoenen moleculen tegelijk, waardoor deze methode ideaal is voor het bestuderen van stroming en diffusie over cellen en weefsels.

Verbetering van de technologie

Hoewel deze methode beweging over viskeuze gels of plasmamembranen detecteert, het is niet in staat om een ​​kaart te maken van deeltjes die door een echte cel bewegen. Echter, Saha en Saffarian werken nu samen met onderzoekers van ThermoFisher Scientific (FEI) in Duitsland om een ​​prototype van een microscoop te bouwen met veel snellere detectoren die beweging in levende cellen kunnen vastleggen. Ze maken deel uit van een octrooiaanvraag voor de technologie en zullen de gegevens van de experimenten analyseren.

"We kunnen deze methode al gebruiken voor langzame processen, maar in ons laboratorium, we zijn tot op zekere hoogte biologen. We willen echt begrijpen hoe biologie werkt, en de drijfveer achter al deze methode-ontwikkeling is om te begrijpen, wat is de gekke dans van moleculen in cellen en weefsels die de echt exotische biologie vooruit helpt? Om daar te komen, we hebben veel snellere detectoren nodig, ' zei Safari.