Rice University-onderzoekers hebben een nieuwe dimensie toegevoegd aan hun baanbrekende techniek die de mogelijkheden van standaard laboratoriummicroscopen uitbreidt.

Twee jaar geleden, het Rice-lab van chemicus Christy Landes introduceerde supertemporele resolutiemicroscopie, een techniek waarmee onderzoekers fluorescerende moleculen 20 keer sneller in beeld konden brengen dan traditionele laboratoriumcamera's normaal toestaan. Ze hebben nu een algemene methode ontwikkeld om een ​​microscoop 3D ruimtelijke informatie te laten vastleggen, samen met de vierde dimensie, moleculaire beweging in de tijd.

Dit, ze zeggen, zal wetenschappers die dynamische processen bestuderen helpen om te zien waar moleculen van belang zich bevinden en hoe snel ze bewegen, bijvoorbeeld, binnen levende cellen.

De Rice-methode om de mogelijkheden van bestaande wide-field fluorescentiemicroscopen uit te breiden, wordt gedetailleerd beschreven in het open-access paper van het team in Optica Express .

Het beschrijft het maken van aangepaste fasemaskers:transparant, draaiende schijven die de lichtfase manipuleren om de vorm van het beeld dat door de camera van de microscoop is vastgelegd te veranderen. De vorm bevat informatie over de 3D-positie van een molecuul in de ruimte en hoe het zich in de loop van de tijd gedraagt ​​binnen het gezichtsveld van de camera.

Een fasemasker verandert wat een ongemak lijkt, de wazige klodder in een microscoopbeeld, in een bezit. Wetenschappers geven deze blob een naam - puntspreidingsfunctie - en gebruiken deze om details te krijgen over objecten onder de diffractielimiet die kleiner zijn dan alle zichtbare lichtmicroscopen kunnen zien.

Het oorspronkelijke werk maakte gebruik van een roterend fasemasker dat licht van een enkel fluorescerend molecuul transformeerde in wat de onderzoekers een roterende dubbele helix noemden. Het vastgelegde beeld verscheen op de camera als twee gloeiende schijven, als de lobben van een halter. In het nieuwe werk de roterende halters lieten hen niet alleen zien waar moleculen zich in de driedimensionale ruimte bevonden, maar gaf ook elk molecuul een tijdstempel.

De kern van het nieuwe werk ligt in de algoritmen van hoofdauteur en Rice elektro- en computertechniek-alumnus Wenxiao Wang. De algoritmen maken het praktisch om aangepaste fasemaskers te ontwerpen die de vorm van de puntspreidingsfunctie wijzigen.

"Met het masker met dubbele helixfase, de tijdinformatie en ruimtelijke informatie waren verbonden, " zei co-auteur Chayan Dutta, een postdoctoraal onderzoeker in het lab van Landes. "De rotatie van de lobben kan ofwel 3D-ruimte of snelle tijdinformatie uitdrukken, en er was geen manier om het verschil tussen tijd en ruimte te zien."

Betere fasemaskers lossen dat probleem op, hij zei. "Het nieuwe fasemaskerontwerp, wat we een strekkend kwabfasemasker noemen, ontkoppelt ruimte en tijd, "Zei Dutta. "Als de doelen zich op verschillende diepten bevinden, de lobben strekken zich verder uit of komen dichterbij, en de tijdinformatie wordt nu alleen in de rotatie gecodeerd."

De truc is om het licht bij het draaiende fasemasker te manipuleren om het patroon voor verschillende diepten te optimaliseren. Dat wordt bereikt door het brekingspatroon dat door het algoritme in het masker is geprogrammeerd. "Elke laag is in het algoritme geoptimaliseerd voor verschillende detectiedieptes, " zei afgestudeerde student en co-auteur Nicholas Moringo. "Waar voorheen, we konden in de loop van de tijd objecten in twee dimensies zien, nu kunnen we alle drie de ruimtelijke dimensies en het snelle tijdgedrag tegelijkertijd zien."

"Breedveld fluorescentiemicroscopen worden op veel gebieden gebruikt, vooral celbiologie en medische beeldvorming, "Zei Landes. "We beginnen net aan te tonen hoe het manipuleren van de lichtfase binnen een microscoop een redelijk eenvoudige manier is om de ruimte- en tijdresolutie te verbeteren in vergelijking met het ontwikkelen van nieuwe fluorescerende tags of het ontwerpen van nieuwe hardwareverbeteringen."

Een belangrijk resultaat dat een brede aantrekkingskracht zou kunnen hebben, ze zei, is dat de onderzoekers het ontwerp van het fasemasker hebben gegeneraliseerd, zodat onderzoekers maskers kunnen maken om vrijwel elk willekeurig patroon te creëren. Laten zien, de groep ontwierp en vervaardigde een masker om een ​​complexe puntspreidingsfunctie te creëren die RICE op verschillende brandpuntsdiepten beschrijft. Een video laat zien dat de spookachtige letters verschijnen en verdwijnen terwijl de microscoop naar verschillende diepten boven en onder het brandpuntsvlak beweegt.

Een dergelijke flexibiliteit zal nuttig zijn voor toepassingen zoals het analyseren van processen in levende kankercellen, een project dat het lab binnenkort hoopt na te streven met partners van het Texas Medical Center.

"Als je een cel op een glasplaatje hebt, je zult begrijpen waar objecten in de cel zich in relatie tot elkaar bevinden en hoe snel ze bewegen, "Zei Moringo. "Camera's zijn niet snel genoeg om alles vast te leggen wat er in een cel gebeurt, maar ons systeem kan dat wel."