Een recent ontwikkelde techniek die bekend staat als light-sheet fluorescentiemicroscopie heeft geleid tot veel biologische ontdekkingen door onderzoekers in staat te stellen 3D-beelden te maken van weefsel, zelfs levende dierlijke embryo's, met behulp van fluorescerende tags. Nutsvoorzieningen, onderzoekers rapporteren het vermogen om de beelddiepte van fluorescentiemicroscopie met lichtplaten te vergroten met behulp van een optisch fenomeen dat bekend staat als drie-fotonabsorptie.

In het tijdschrift The Optical Society (OSA) Optica Letters , de onderzoekers rapporteren in detail hoe absorptie van drie fotonen kan worden gebruikt met fluorescentiemicroscopie met lichtplaten om dieper in weefsels in beeld te brengen. Als demonstratie, ze gebruikten de gecombineerde techniek om heldere beelden te produceren door een bal van gekweekte cellen, bekend als een sferoïde, ongeveer 450 micron in diameter.

"Deze demonstratie is erg belangrijk omdat het inspeelt op een onvervulde behoefte aan betere beeldvorming op diepte, die wetenschappers zouden kunnen helpen betere gegevens over biologische processen te verkrijgen, " zei onderzoeksteamleider, Kishan Dholakia van de Universiteit van St. Andrews in het Verenigd Koninkrijk. "Deze benadering zou vooral nuttig kunnen zijn voor neurowetenschappelijke en ontwikkelingsbiologische studies en zou kunnen worden toegepast bij het op een geautomatiseerde manier afbeelden van meerdere monsters voor het ontdekken van geneesmiddelen."

Het licht dat nodig is om fluorescerende labels af te beelden, kan schadelijk en zelfs dodelijk zijn voor delicate biologische monsters zoals hersenweefsel of dierlijke embryo's die worden gebruikt om ontwikkelings- en ziekteprocessen te bestuderen. Light-sheet fluorescentiemicroscopie maakt snelle, beeldvorming met hoge resolutie met weinig optische schade omdat het een monster verlicht met slechts een dun vel licht; andere delen van het monster krijgen geen onnodige blootstelling aan licht.

"We verwachten dat fluorescentiemicroscopie met drie fotonen een grote impact zal hebben op de beeldvorming van de hersenen bij knaagdieren zoals muizen en ratten, waar het kan worden gebruikt om zeer brede veldbeelden vast te leggen met subcellulaire resolutie, ", zei de eerste auteur van de krant, Adrià Escobet-Montalbán.

Diepere beeldvorming

De onderzoekers wilden de fluorescentiemicroscopie met drie foton-lichtplaten vergelijken met de eerder gebruikte twee-fotonabsorptie. Bij multifotonabsorptie, het fluorescerende label geeft licht af na absorptie, of opgewonden zijn door, twee of drie fotonen in plaats van het ene foton dat wordt gebruikt om traditionele fluorescentie te produceren.

Multiphoton-absorptie vermindert onscherp licht en minimaliseert licht dat het monster zou kunnen beschadigen omdat het langere golflengten gebruikt, die minder door weefsel worden verspreid, en door het excitatielicht te beperken tot een klein volume. Wanneer drie fotonen worden gebruikt om fluorescentie te produceren in plaats van twee, deze voordelen worden versterkt.

Om hun nieuwe techniek te demonstreren, de onderzoekers gebruikten een standaard optische opstelling voor light-sheet fluorescentiemicroscopie met een gepulseerde laser die traditioneel wordt gebruikt voor excitatie met twee fotonen. Hoewel deze laser niet het meest geschikt was voor het creëren van efficiënte drie-fotonexcitatie, het was ideaal voor het vergelijken van twee-foton en drie-foton excitatie.

Het onderzoeksteam beeldde sferoïden van menselijke embryonale niercellen af ​​met behulp van twee-foton en drie-foton-excitatie. In de buurt van het oppervlak van de sferoïde, beide beeldvormende modaliteiten presteerden op dezelfde manier. Echter, aan de andere kant van de sferoïde, de beeldkwaliteit voor de fluorescentiemicroscopie met drie foton-lichtplaten behield het beeldcontrast, terwijl de kwaliteit van het twee-fotonbeeld aanzienlijk afnam.

Optimalisatie van de techniek

Om de diepteweergave en het gezichtsveld verder te verbeteren, experimenteerden de onderzoekers met het veranderen van het lichtintensiteitsprofiel van de laser in een Bessel-straal, met een centrale heldere kern omgeven door concentrische ringen, in plaats van de traditionele massieve Gauss-laserstraal zoals die van een laserpointer.

"Bessel-bundels kunnen worden gebruikt in twee-foton-lichtbladmodus, maar kunnen potentiële artefacten opleveren vanwege hun concentrische ringen, " zei co-auteur Federico Gasparoli. "Voor de eerste keer, laten we numeriek en experimenteel zien dat deze problemen worden onderdrukt in fluorescentiemicroscopie met drie fotonen lichtplaten en dat de bundel nog dieper gaat, waardoor deze aanpak zeer aantrekkelijk is."

Volgende, de onderzoekers zijn van plan de techniek te verbeteren door lasersystemen met langere golflengten te gebruiken die speciaal zijn ontworpen voor absorptie van drie fotonen. Dit zou beeldvorming op grotere diepte mogelijk moeten maken. parallel, de onderzoekers werken aan manieren om het licht te detecteren dat wordt uitgestraald door fluorescerende labels diep in monsters.