Chemici bij ITbM, Nagoya University heeft een super-fotostabiele fluorescerende kleurstof ontwikkeld, PhoxBright 430 (PB430) genaamd, om cellulaire ultrastructuur te visualiseren met superresolutiemicroscopie. De uitzonderlijke fotostabiliteit van deze nieuwe kleurstof maakt continue STED-beeldvorming mogelijk. Met zijn vermogen om eiwitten te labelen met fluorescerende labels, PB430 demonstreert het gebruik ervan in de 3D-constructie en veelkleurige beeldvorming van biologische structuren.

Superresolutie fluorescentiemicroscopie, die in 2014 de Nobelprijs voor de Scheikunde ontving, stelt onderzoekers in staat biologische systemen te visualiseren en een gedetailleerd inzicht te krijgen in de complexe dynamiek van biomoleculen. Vooral, gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie wordt veel gebruikt om processen in levende systemen te onderzoeken vanwege de hoge acquisitiesnelheid en compatibiliteit met veel biologische monsters.

Chemici van het Institute of Transformative Bio-Molecules (ITbM) van de Universiteit van Nagoya hebben een nieuwe fotostabiele fluorescerende kleurstof ontwikkeld, PhoxBright 430 (PB430), die continue superresolutie STED-beeldvorming van fluorescent gelabelde cellen mogelijk maakt. Aangezien PB430 een functionele groep bevat die conjugatie met een antilichaam mogelijk maakt, specifieke biomolecuuldoelen in een cel kunnen worden gekleurd door immunofluorescentie. De uitzonderlijke fotostabiliteit van PB430 stelde onderzoekers in staat om een ​​3D STED-beeld van cellulaire microtubuli te construeren en veelkleurige STED-beeldvorming van fluorescerende, immunogelabelde cytoskeletten te bereiken door fotostabiele PB430 en in de handel verkrijgbare kleurstoffen te combineren.

De unieke eigenschappen van PB430 maken het een krachtig hulpmiddel om de structuren en functies van cellen te onthullen, en kan worden toegepast op de langdurige visualisatie van de beweging van organellen en moleculen in cellen. De resultaten van deze studie werden onlangs gerapporteerd in de Tijdschrift van de American Chemical Society .

Om een ​​hoge resolutie in STED-microscopie te bereiken, een biologisch monster gelabeld met een fluorofoor (een fluorescerende kleurstof die wordt gebruikt om biologische monsters zoals eiwitten, weefsels en cellen) wordt bestraald met een fluorescentie-excitatiestraal samen met een donutvormige STED-straal om de excitatie van de omringende moleculen te onderdrukken. Hoewel het een krachtige techniek is, de behoefte aan een STED-straal met hoge intensiteit, die fotobleking van kleurstoffen veroorzaakt, heeft het praktische gebruik van STED-microscopie in continue live-celbeeldvorming geremd.

Onderzoekers hebben eerder melding gemaakt van een fluorescerende kleurstof, C-Naphox, die een sterke fotostabiliteit vertoont in STED-beeldvorming. De groep heeft nu de structuur van C-Naphox geoptimaliseerd en de nieuwe fotostabiele fluorescerende kleurstof ontwikkeld, die kunnen worden gebruikt voor de visualisatie van structuren in cellen.

"C-Naphox heeft aangetoond een extreem fotostabiele kleurstof te zijn voor de STED-beeldvorming van verschillende materialen, dus besloten we de eigenschappen ervan verder af te stemmen en toe te passen om ultrastructuren te visualiseren, " zegt Masayasu Taki, een universitair hoofddocent bij ITbM en een van de leiders van dit onderzoek. "Onze nieuwe kleurstof, PB430 vertoont verhoogde oplosbaarheid in water, fluoresceert efficiënt in waterige media, en is in staat om antilichamen te labelen. We waren verheugd om te zien dat het ook een hoge fotostabiliteit vertoont onder STED-omstandigheden, ' zegt Taki.

Chenguang Wang, een postdoctoraal onderzoeker in de onderzoeksgroep van professor Shigehiro Yamaguchi bij ITbM, PB430 gesynthetiseerd en de STED-beeldvormingsexperimenten uitgevoerd. Op een vergelijkbare manier als C-Naphox, de nieuwe fluorescerende kleurstof is luchtstabiel en bestaat uit een structureel versterkte, ring-gefuseerd, π-geconjugeerd skelet dat een fosfool P-oxide-eenheid bevat, wat de oorsprong is van de naam PhoxBright. In plaats van de trifenylaminegroep, PB430 heeft een carbonzuurgroep die kan conjugeren aan antilichamen voor immunolabeling via vorming van een N-hydroxylsuccinimidyl (NHS) ester.

STED-beeldvormingsexperimenten van PB430-geconjugeerde antilichamen in gefixeerde HeLa-cellen leidden tot fluorescentiebeelden van immunogelabelde microtubuli, met slechts lichte fotobleking. PB430 fungeerde als een fluorescerend label voor eiwitten en de fluorescentie-intensiteit ervan bleef behouden, zelfs wanneer het werd geconjugeerd.

"De hoge fotostabiliteit van PB430 maakt fluorescentiebeeldvorming mogelijk die niet gemakkelijk mogelijk was met conventionele kleurstoffen, " legt Taki uit. "Bijvoorbeeld, PB430 kan worden gebruikt in 3D-STED-beeldvorming van het cytoskelet, omdat het bestand is tegen de continue STED-straal in de z-as na beeldvorming in de xy-as."

Verder, de groep toonde aan dat PB430 kan worden toegepast op veelkleurige STED-beeldvorming door gebruik te maken van het verschil in fotostabiliteit tussen verschillende fluorescerende kleurstoffen. Ze voerden STED-beeldvormingsexperimenten uit van microtubuli en vimentine (tussenliggende filamenteiwitten) van het cytoskelet, immunogelabeld met PB430 en Alexa Fluor 430 (een fluorescerende kleurstof), respectievelijk. Terwijl Alexa Fluor 430 fotobleekt na het maken van de eerste STED-opname, de tweede afbeelding toont alleen PB430-gelabelde microtubuli. Door de eerste afbeelding van de tweede afbeelding af te trekken, worden de Alexa Fluor 430-gelabelde vimentinefilamenten onthuld.

"Gebruikelijk, multicolor STED-beeldvorming vereist meerdere excitatielasers en een enkele STED-laserstraal, maar in de combinatie van Alexa Fluor 430 met PB430, we hebben maar één paar excitatie- en STED-lasers nodig, " legt Taki uit. "Door PB430 te gebruiken, wij geloven dat het mogelijk zal zijn om veelkleurige STED-beeldvorming uit te voeren met een aantal verschillende combinaties van verschillende fluorescerende kleurstoffen. De volgende stap is het verbeteren van de celmembraanpermeabiliteit van de kleurstof om de functies van vele andere celstructuren te visualiseren, " hij gaat door.

"Ons onderzoek heeft aangetoond dat de sterke fotostabiliteit en fysiologische compatibiliteit van PB430 herhaalde beeldvorming mogelijk maakt, evenals de 3D-beeldvorming en meerkleurige beeldvorming van cellen door STED-microscopie, " zegt Yamaguchi. "We hopen dat we onze fluorescerende kleurstof kunnen toepassen voor langdurige beeldvorming van levende cellen door STED-microscopie en microscopie met één molecuul, om verschillende biologische processen te onderzoeken."