Door Anne Mullenniex Bijgewerkt op 24 maart 2022

Kwantificeer uw RNA-monster door de absorptie van ultraviolet licht (UV) te meten. Een nanodruppelspectrofotometer gebruikt slechts één of twee microliter van uw monster, dat u kunt terugwinnen. Andere spectrofotometers vereisen een veel groter monster. De uitdovingscoëfficiënt voor nucleotiden bij een UV-golflengte van 260 nm in een lichtpad van 1 cm is 20. Gebaseerd op deze uitstervingscoëfficiënt is de absorptie van 40 µg/ml RNA onder dezelfde omstandigheden één. Met behulp van deze informatie kunt u de concentratie van uw RNA-monster berekenen.

Stap 1

Maak indien nodig een verdunning van uw monster. Een standaardverdunning voor een microcuvette is 1:40. Maak deze verdunning door 2 µl RNA-monster toe te voegen aan 78 µl steriel water.

Stap 2

Volg de protocollen van uw specifieke spectrofotometer om de machine te kalibreren met behulp van een blanco en bepaal vervolgens de optische dichtheid van uw monster bij een UV-golflengte van 260 nm.

Stap 3

Vermenigvuldig de absorptie van uw monster met uw verdunningsfactor met 40 μg RNA/ml. De vergelijking zou zijn:"RNA-concentratie (μg/ml) =(OD260) x (verdunningsfactor) x (40μg RNA/ml)/(1 OD260-eenheid)" (Hofstra.edu) Bijvoorbeeld:als u uw monster met 1:40 verdunde en uw absorptiewaarde was 0,08, zou u 0,08 x 40 x 40 =128 µg/ml =0,13 vermenigvuldigen. µg/μL

Stap 4

Ontdek de zuiverheid van uw monster door nog een absorptiemeting uit te voeren bij een UV-golflengte van 280 nm. De verhouding OD 260/OD 280 geeft aan of – en in welke mate – uw monster verontreinigd is met eiwit of fenol. Een resultaat van 1,8 tot 2,0 duidt op kwaliteits-RNA.

Dingen die nodig zijn

• Spektrofotometer
• Rekenmachine

TL;DR (te lang; niet gelezen)

Vergeet niet uw spectrofotometer te kalibreren. Het gebruik van een snelle elektroforetische gel zal uw spec-resultaten bevestigen.

Waarschuwing

Ga er niet vanuit dat uw monster puur is. Door de tijd te nemen voor een OD260/OD280-verhouding bespaart u later tijd en geld.