protocol voor nitraatreductasestest met behulp van natriumnitriet als standaard

Dit protocol schetst een gemeenschappelijke methode voor het meten van nitraatreductase -activiteit met behulp van natriumnitriet als standaard.

Materialen:

* plantmateriaal: Verse bladeren, wortels of andere weefsels die nitraatreductase bevatten.

* extractiebuffer:

* 100 mm Tris-HCl-buffer, pH 7,5

* 1 mm EDTA

* 10 mm dtt (dithiothreitol)

* 0,1% (w/v) runderserumalbumine (BSA)

* Reactiemengsel:

* 100 mm kaliumfosfaatbuffer, pH 7,5

* 10 mm natriumnitraat

* 1 mm NADH

* Natriumnitriet standaardoplossing: Bereid een standaardoplossing voor bekende concentratie (bijv. 100 ppm).

* Griess reagens: (Zie specifieke protocolinstructies)

* spectrofotometer: Voor het meten van de absorptie bij 540 nm.

* centrifuge: Voor het scheiden van celafval.

* ijsbad: Om koude temperaturen te behouden.

* pipetten en tips: Voor nauwkeurige volumemetingen.

Procedure:

1. Voorbereiding van het monster:

* Oogstplantenmateriaal en spoel snel met koud gedestilleerd water.

* Weeg een geschikte hoeveelheid weefsel (bijv. 0,1-1 g) en maal het in een mortel en stamper met vloeibare stikstof of met behulp van een homogenisator in extractiebuffer.

* Centrifugeer het homogenaat bij 10.000 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C om celafval te verwijderen. Het supernatant is je enzymextract.

2. Nitraatreductase -test:

* Bereid een reeks buizen die het reactiemengsel bevatten, inclusief spaties zonder enzymextract en buizen met verschillende concentraties natriumnitrietstandaard.

* Voeg een geschikt volume enzymextract toe aan de reactiebuizen.

* Start de reactie door NADH toe te voegen.

* Incubeer de buizen gedurende een specifieke tijd bij 30 ° C (bijv. 30 minuten).

* Beëindig de reactie door Griessreagens toe te voegen.

3. Meting van nitrietproductie:

* Incubeer de buizen minimaal 15 minuten in het donker om de kleurontwikkeling mogelijk te maken.

* Meet de absorptie bij 540 nm met behulp van een spectrofotometer.

* Bereid een standaardcurve voor met behulp van de bekende concentraties natriumnitriet.

* Bereken de hoeveelheid nitriet geproduceerd door het enzymextract met behulp van de standaardcurve.

4. Berekening van nitraatreductase -activiteit:

* Uitdruk nitraatreductase -activiteit als µmoles van nitriet geproduceerd per minuut per gram vers gewicht (FW) of eiwit .

Opmerking:

* Dit protocol is een basisoverzicht en specifieke wijzigingen kunnen nodig zijn, afhankelijk van de plantensoort en de experimentele opstelling.

* Zorg ervoor dat alle oplossingen vers worden bereid en op de juiste manier worden opgeslagen.

* Gebruik hoogwaardige reagentia voor nauwkeurige resultaten.

* Controle voor achtergrondabsorptie door het meten van de absorptie van spaties zonder enzymextract.

* Herhaal de test minstens drie keer om reproduceerbaarheid te garanderen.

Griess reagens:

* Het Griess-reagens wordt gebruikt om nitriet te detecteren door ermee te reageren om een ​​paarse gekleurde azo-kleurstof te produceren.

* Verschillende Griess -reagentia kunnen worden gebruikt, dus raadpleeg het specifieke protocol voor voorbereiding en gebruik.

Alternatieve methoden:

* Andere methoden voor het meten van nitraatreductase -activiteit omvatten het gebruik van nitraat als substraat en het detecteren van de vermindering van nitraat tot nitriet.

* spectrofotometrische meting kan worden gebruikt om de verandering in de NADH -concentratie in de loop van de tijd direct te meten.

Interpretatie:

De nitraatreductase -activiteit is een indicator voor het vermogen van de plant om nitraat te verminderen tot nitriet, wat een cruciale stap is in stikstofassimilatie. Het vergelijken van de activiteit in verschillende weefsels of onder verschillende omstandigheden kan waardevolle informatie onthullen over het stikstofmetabolisme van de plant.

Meer informatie:

* protocolaanpassingen voor specifieke plantensoorten of omstandigheden: Raadpleeg relevante wetenschappelijke literatuur of contact -experts voor richtlijnen.

* Problemen oplossen: Raadpleeg de problemen met het oplossen van problemen of raadpleeg experts als u problemen ondervindt met de test.

Dit protocol biedt een algemeen kader voor het meten van nitraatreductase -activiteit met behulp van natriumnitriet als standaard. Pas het aan aan uw specifieke behoeften en zorg voor nauwkeurige resultaten.