Het team stond onder leiding van professor Hirohide Saito (Department of Life Science Frontiers, CiRA), Dr. Kaoru R. Komatsu (een voormalig promovendus bij CiRA), universitair hoofddocent Kazumitsu Onizuka en professor Fumi Nagatsugi (Instituut voor Multidisciplinair Onderzoek voor geavanceerde materialen, Tohoku University).

Van recente SARS-CoV-2-mRNA-vaccins ter bestrijding van de COVID-19-pandemie tot risdiplam, een RNA-splitsingsmodificator die door de Amerikaanse Food and Drug Administration is goedgekeurd voor spinale musculaire atrofie:het woord ‘RNA’ is in de algemene taal terechtgekomen omdat het zowel nieuwe klassen van therapeutische middelen en medicijndoelen.

Ons begrip van hoe verschillende RNA-sequenties en op hun beurt structuren de interacties met kleine moleculen zoals medicijnverbindingen of grote biomoleculen zoals eiwitten dicteren, blijft echter onvolledig.

In een eerdere studie ontwierpen professor Saito en zijn onderzoeksteam een ​​systeem genaamd gevouwen RNA-elementprofilering met structuurbibliotheek, of FOREST, om de moleculaire details te onderzoeken van hoe RNA interageert met bekende RNA-bindende eiwitten.

Voor deze nieuwe studie illustreerde het gezamenlijke onderzoeksteam, in samenwerking met onderzoekers van de Tohoku Universiteit, hoe FOREST kan worden gebruikt om kleine moleculaire interacties met RNA te analyseren.

Het onderzoeksteam valideerde eerst de toepasbaarheid van de FOREST-aanpak op kleine moleculen door te onderzoeken hoe een RNA-structuurbibliotheek interageert met bekende kleine moleculaire RNA-interactors:G-clamp en thiazine-oranje (TO)-derivaten.

De onderzoekers isoleerden RNA-structuren gebonden aan de G-clamp uit een bibliotheek die meer dan 1.800 RNA-sequenties omvatte, afgeleid van menselijke pre-miRNA's en andere repetitieve en controlesequenties. Omdat deze RNA-structuren zijn gekoppeld aan een fluorescerende kleurstof en RNA-barcode, kunnen ze gemakkelijk worden gedecodeerd en gekwantificeerd door een DNA-microarray met sequenties die complementair zijn aan de RNA-barcodes om een ​​kwantitatieve analyse te bieden van hoe RNA-structuren interageren met het specifieke kleine molecuul van belang.

Zoals verwacht identificeerden ze preferentiële binding aan guanosine (G)-bevattende enkel- en dubbelstrengige RNA-sequenties (respectievelijk ssRNA en dsRNA) door middel van G-clamp. Uit de RNA-structuurbibliotheek koos het onderzoeksteam sequenties die een binding met hoge, gemiddelde of lage affiniteit aan de G-clamp vertonen, voor validatie door een onafhankelijk, op fluorescentie gebaseerd experiment dat direct de schijnbare dissociatieconstanten van individuele interacties meet.

Opmerkelijk genoeg observeerden ze een goede correlatie tussen de relatieve bindingsaffiniteit geschat door de FOREST-benadering en de schijnbare dissociatieconstanten bepaald door de op fluorescentie gebaseerde bindingstest, wat de hoge robuustheid van deze methode voor het kwantificeren van kleine molecuul-RNA-interacties aangeeft.

Bovendien ontdekten ze, door een specifieke RNA-lusstructuur te muteren met meerdere guanosines op verschillende locaties, dat G-clamp niet in gelijke mate interageert met alle guanosines op de lus, maar dat aanvullende structurele context de interactie kan beïnvloeden.

Omgekeerd zijn TO-derivaten algemeen gebruikte probes voor fluorescentie-indicatorverdringingstests (FID-tests). De onderzoekers mengden vervolgens TO en TO-3 afzonderlijk met een uitgebreide RNA-structuurbibliotheek met extra sequenties afgeleid van RNA's van het SARS-CoV-2- en influenza A-virus om TO-derivaten beter te karakteriseren voor RNA-metingen.

Zoals verwacht, terwijl er geen correlatie was tussen bindingsprofielen van RNA-structuren die interageren met G-clamp en TO-derivaten, deelden TO en TO-3 vergelijkbare bindingsprofielen met enkele kleine verschillen.

Verdere vergelijkingen tussen TO-N₃ , TO-N₃ -2 en TO-3-N₃ onthulde dat de linkerpositie een bescheiden invloed heeft op RNA-bindingsprofielen. Bovendien hebben de onderzoekers op basis van deze bindingsprofielen enkele basis- en luspositionele voorkeuren onderscheiden die TO-derivaten hebben bij interactie met RNA-structuren.

Het onderzoeksteam breidde bovendien hun analyse van TO-derivaten uit door de relatieve bindingsaffiniteiten bepaald door FOREST te vergelijken met de schijnbare dissociatieconstanten gemeten voor in de handel verkrijgbare fluorescerende nucleïne-indicatoren, TO-PRO-1 en TO-PRO-3, door de op fluorescentie gebaseerde bindingstest. .

Uit deze analyse bleek dat TO-N₃ -2 kan het bindingsprofiel van TO-PRO1 nauwkeuriger weergeven in vergelijking met TO-3-N₃ , beide TO-N₃ -2 en TO-3-N₃ simuleren TO-PRO-3 ongeveer even goed, waardoor cruciale structurele inzichten worden geboden voor het verbeteren van de combinatie van doel-RNA en fluorescente indicatoren voor FID-tests.

Met behulp van de bindingsprofielen die voor TO-derivaten zijn bepaald, selecteerde het onderzoeksteam combinaties van fluorescerende indicatoren (TO-PRO-1 of TO-PRO-3) en pre-miRNA-sequenties waarvan eerder is aangetoond dat ze ontregeld zijn in tumoren met intermediaire bindingsaffiniteiten voor FID-assays.

Als proof-of-concept hebben de onderzoekers een in de handel verkrijgbare chemische bibliotheek met 118 verbindingen gescreend om kleine moleculen te identificeren die in staat zijn te interageren met ziektegerelateerde pre-miRNA's. Door deze inspanning identificeerden ze baicaleïne (Bai), myricetine (Myr), chelerythrinechloride (Che) en AS 602801 (AS) als kandidaat-hitverbindingen. Terwijl het bekend is dat Myr en Che DNA en RNA binden, was dit de eerste demonstratie van AS als nucleïnezuur-interactor.

De onderzoekers observeerden met name verschillende resultaten wanneer TO-PRO-1 of TO-PRO-3 werd gebruikt als de fluorescerende indicator, wat suggereert dat verschillende indicatoren moeten worden gebruikt om vals-positieve en negatieve identificaties te voorkomen. Verder onderzoek van AS bevestigde de binding aan verschillende menselijke pre-miRNA's van belang, maar de onderzoekers merkten ook dat de verbinding sterke oplichtende eigenschappen vertoonde bij interactie met RNA.

Structureel onderzoek van de verbinding suggereert dat deze een chemische groep bevat die waarschijnlijk verantwoordelijk is voor de oplichtende eigenschappen, waardoor het een interessante verbinding is voor verdere ontwikkeling tot een nieuwe RNA-interactor en fluorescente probe.

In deze studie illustreert de gezamenlijke onderzoeksinspanning nogmaals de toepasbaarheid van de FOREST-methodologie, niet alleen voor het inspecteren van RNA-eiwitinteracties, maar ook voor het onderzoeken van de fijne details van interacties tussen RNA en kleine moleculen.

Gezien het enorme potentieel voor RNA als nieuwe therapeutische benadering in de geneeskunde van de volgende generatie, zal het vermogen om interacties tussen kleine moleculen en RNA op grote schaal systemisch te karakteriseren enorme gevolgen hebben voor fundamenteel RNA-onderzoek en de vertaling van die kennis in therapieën.

Meer informatie: Ryosuke Nagasawa et al, Grootschalige analyse van interacties tussen kleine moleculen en RNA met behulp van gemultiplexte RNA-structuurbibliotheken, Communicatiechemie (2024). DOI:10.1038/s42004-024-01181-8

Journaalinformatie: Communicatiechemie

Aangeboden door de Universiteit van Kyoto